21
основаны насп особ ности микроорганизмовп роду цировать Н 2S, который
всту п ает вреакцию |
с лимоннокислым висму том и об разу ет соединение |
|
черного цвета - |
сернистый |
висму т. Среда резко у гнетает рост |
соп у тству ю щ ей микроф лоры |
за счет ингиб иру ю щ его действия |
б риллиантовогозеленогоису льф итанатрия. |
|
||
Подготовленныек у п отреб лению |
п итательныесреды п роверяю тна |
||
стерильность. Д ля этого их |
ставят в термостат п ри 37 °С. |
Среды, |
|
п ростерилизованные в автоклаве, выдерж иваю т в термостате 1 |
су тки, |
||
п ростерилизованные теку чим |
п аром |
- 3 су ток. Проросш ие |
среды |
б раку ю тся и отп равляю тся вмойку , аостальные б еру тся враб оту или оставляю тсянахранение. Н екоторыеп итательныесреды мож ноготовить вп рок на2 - 3 недели. Создавать зап асы наб олееп родолж ительноевремя нецелесооб разно, так как врезу льтатедолгогохранениясреды высыхаю ти изменяю тсвойства.
Х ранить п итательные среды лу чш е всего вхолодильниках, однако хранениеих возмож нои п ри комнатнойтемп ерату ревш каф ах с секциями. В каж доеотделение со средой вкладываю тоб язательно листок б у маги с названием п итательной среды и даты ее п риготовления. Помещ ение, в котором хранятсясреды, долж ноб ыть п рохладное, защ ищ енноеотсвета, су хое. Поверх п роб ок наф лаконы и колб ы надеваю тб у маж ныеколп ачки
илип араф иновые«ш ап очки» . |
|
|
|
||
За д а нuед л я вы по л ненuя л а бо р а т о р но йр а бо т ы |
|
||||
О своить технику |
п осевап етлей натвердые и ж идкие п итательные |
||||
среды. |
|
|
|
|
|
М ет о д ическиеука за ния |
|
|
|
||
Т Е Х Н И К А |
ПО СЕ В О В |
И |
ПЕ РЕ СЕ В О В |
К У Л ЬТ У Р |
|
М И К РО О РГА Н И ЗМ |
О В |
|
|
|
|
У ниверсальным инстру ментом для п роизводствап осевовявляется |
|||||
б актериальная п етля. |
К роме нее, для |
п осева у колом |
п рименяю т |
||
сп ециальну ю б актериальну ю иглу , |
а для п осевов на чаш ках Петри - |
металлическиеили стеклянныеш п атели. Д ляп осевовж идких материалов наряду с п етлей исп ользу ю тп астеровски и граду ированныеп ип етки.
По сев в ча шки П ет р и с пл о т но йпит а т ел ьно йср ед о й
По сев пет л ей: п осевной материал втираю т п етлей вп оверхность
среды у края чаш ки, изб ыток снимаю т, п роколов п етлей агар, а оставш ийсяматериалрассеиваю тп араллельнымиш трихамип остерильной п оверхностисреды. Э тонаиб олеерасп ространенный сп особ п осева.
П о сев шпа т ел ем: материалнаносят нап оверхность среды п етлей или п ип еткой, а затем стеклянным или металлическим ш п ателем тщ ательновтираю тегоп овсей п оверхности агара. При этом левой ру кой п ридерж иваю г слегка п риоткрыту ю крыш ку и одновременно вращ аю т чаш ку . После п осеваметаллический ш п атель п рокаливаю т вп ламени горелки, астеклянный п омещ аю твдезинф ициру ю щ ий раствор.
22
По сев т а мпо но м: тамп он с исследу емым материалом вносятвчаш ку
икру говыми движ ениями втираю тего содерж имоевп оверхность среды, одновременновращ аятамп они чаш ку .
П о сев на сект о р ы : дно чаш ки расчерчиваю т на секторы, п осев п роизводят зигзагооб разными движ ениями от края чаш ки к центру так, чтоб ы ш трихи с одногонеп ереходили надру гой.
П о сев га зо но м: 1 мл исследу емого материала(ж идкая б у льонная ку льту ра или взвесь микроб ов в ф изиологическом растворе) наносят п ип еткой нап оверхность среды и тщ ательно расп ределяю тж идкость п о всей ееп оверхности. И зб ыток материалаотсасываю тп ип еткой и вместес ней п омещ аю т в дезинф ициру ю щ ий раствор. После п осева чаш ки закрываю ти п ереворачиваю тих вверх дном. Н адп иси начаш ках делаю тсо стороны дна, анап роб ирках - вверхней части.
П о сев иссл ед уемо го ма т ер иа л а в т о л щ у пл о т но й пит а т ел ьно й ср ед ы . М атериал, засеваемый втолщ у п итательной среды, долж ен б ыть в ж идком состоянии. Д ляэтогоиз материала, п одлеж ащ егоп осеву , готовят взвесь (в стерильной водоп роводной воде или в ф изиологическом растворе), наб ираю теевп ип етку воб ъ еме0,1; 0,5 или 1 млвзависимости от п редп олагаемого микроб ного загрязнения и выливаю т в п у сту ю стерильну ю чаш ку Петри. В следзаэтим чаш ки заливаю т15 - 20 млМ ПА ,
расп лавленным и осту ж енным до40 – 45 °С (п ри такой темп ерату ре, если п рилож ить п роб ирку сосредой к щ еке, онанедолж навызывать ощ у щ ения ож ога). Д ля равномерного расп ределения исследу емого материала в п итательной средечаш ку с содерж имым б еру твру ки и слегкап окачиваю т вразныестороны.
П о сев на пл о т ны еи ж ид киепит а т ел ьны йср ед ы в пр о бир ка х
При п осеве иноку лятаиз п роб ирки вп роб ирку об е п роб ирки (с п осевным материалом и со средой) держ атслегканаклонно влевой ру ке меж ду б ольш им и у казателыным п альцами так, чтоб ы краяп роб ирок б ыли
наодном у ровне. Бактериальну ю п етлю |
держ ат как п исчее п еро. Петлю |
вертикально п рокаливаю т в п ламени |
горелки. Проб ки из п роб ирок |
вынимаю тп равой ру кой, заж имаяих меж ду мизинцем и ладонью . В ыну в п роб ки, краяп роб ирок об ж игаю твп ламени горелок. Прокаленну ю п етлю вводят через п ламя горелки в п роб ирку с п осевным материалом, охлаж даю т и неб ольш ое количество п осевного материала осторож но п ереносятвп роб ирку сосредой.
1. При п осевенаж идку ю среду п етлю слегкап огру ж аю твж идкость и растираю тп осевной материалнастенкеп роб ирки, п ослечегосмываю т его средой. Д ля п осева ж идкого материала мож но исп ользовать
стерильныеп ип етки (п астеровскиеилиграду |
ированные). |
2. При п осеве на скош енный |
агар материал наносят |
ш трихооб разными движ ениями снизу вверх, начиная с конденсационной воды, аесли агар или ж елатин разлит вп роб ирки столб иком, то п осев п роизводяту колом, п рокалываяп етлейсп осевным материалом столб ик до
23
дна. После п осевап етлю извлекаю т из п роб ирки, п роб ирку закрываю т, п редварительноп роведяеекраячерез п ламягорелки. Петлю п рокаливаю т.
Посевы инку б иру ю тсявтермостатеп ри 37 °Свтечение18 - 24 ч. За это время из отдельных микроб ных клеток ф ормиру ю тся изолированные колонии.
Т ем а 4. М Е Т О Д Ы |
В Ы Д Е Л Е Н И Я , |
К У Л ЬТ И В И РО В А Н И Я И |
|||
И Д Е Н Т И Ф И К А Ц И И Ч И СТ Ы Х К У Л ЬТ У Р БА К Т Е РИ Й |
|
||||
Т ема4.1. ПО Л У Ч Е Н И Е |
Ч И СТ Ы Х |
К У Л ЬТ У Р БА К Т Е РИ Й |
|||
Ч истой |
ку льту рой |
называю т |
п оп у ляцию |
микроорганизмов, |
|
п ринадлеж ащ их |
к одному |
виду . Примером |
чистой |
ку льту ры мож ет |
слу ж итьколония, состоящ аяиз микроб ных клеток одногоитогож евида. Полу чение чистых ку льту р необ ходимо для изу чения морф ологических, ку льту ральных и б иологических свойстввыделенного микроорганизмав целях оп ределения его видовой п ринадлеж ности. Д лявыделения чистых ку льту р п ользу ю тся методом рассевав глу б ине п итательной среды и методом п осеванап оверхность п итательнойсреды (методД ригальского).
П о л учение чист о й кул ьт ур ы мет о д о м р а ссева |
в гл убине ср ед ы . |
|||||
Содерж имое 3 |
- 5 |
п роб ирок, |
в которых |
находится п о 10 - |
15 мл |
|
п итательного |
ж елатина или |
М ПА , расп лавляю т |
в водяной |
б ане. |
||
Расп лавленну ю |
среду |
осту ж аю т до 43 - 45 |
°С и ставят втеп лу ю |
воду , |
||
чтоб ы п реду п редить |
ее засту дневание. В |
одну из |
п роб ирок |
вносят |
исследу емый материал. Затем п ип еткой или п етлей содерж имоеиз п ервой
п роб ирки п ереносят во втору ю , из второй - в третью . |
Д ля лу чш его |
п еремеш ивания материаласо средой засеянные п роб ирки, |
заж авмеж ду |
ладонями, вращ аю т несколько раз водну и затем вдру гу ю сторону . Приготовленныетаким об разом разведениямикроорганизмоввыливаю тиз п роб ирок вчаш ки Петри, об означенные номерами, соответству ю щ ими номерам п роб ирок. Послезасту дневаниясреды сисследу емым материалом
чаш ки п омещ аю т |
в термостат. |
К оличество |
колоний |
в чаш ках |
с |
||
п итательной средойу меньш аетсяп омереразведенияматериала. |
|
||||||
Вы д ел ение |
чист о й |
кул ьт ур ы |
по |
спо со бу |
Др ига л ьско го . |
||
Расп лавленну ю п итательну ю |
среду |
с толщ иной слоя не менее 0,5 |
см |
разливаю тв3 чаш ки Петри. Застывш у ю среду об язательноп одсу ш иваю т.
В п ерву ю |
чаш ку вносятнеб ольш оеколичествоисследу емогоматериалаи |
|
ш п ателем |
Д ригальского или ш п ателем, сделанным |
из п астеровской |
п ип етки, |
втираю т его в п оверхность п итательной |
среды. Д алее, не |
п рож игаяиненаб ираяновогоматериала, ш п атель п ереносятвовтору ю и в третью чаш ки, втираявп оверхность п итательных средоставш ийсянанем материал.
М етод рассева п о п оверхности, п редлож енный Д ригальским, является наиб олее у п отреб ительным для п олу чения чистой ку льту ры микроорганизмов. В местош п ателямож ноп ользоватьсяп етлей. М атериал
24
нап итательной средерасп ределяю тгу стыми п араллельными ш трихами п о
всей чаш кеводном нап равлении. Затем, п оверну вчаш ку на180°, той ж е п етлей п роводят ш трихи в нап равлении, п ерп ендику лярном п ервым ш трихам. В резу льтатенап оверхности п итательной среды вычерчивается гу стаясетка. При таком сп особ еп осеваматериал, содерж ащ ийсянап етле, расходу етсяп остеп енно, и п о линиям сетки, нанесенным вконцеп осева, вырастаю тизолированныеколонии микроб ов.
В ыделение чистой ку льту ры методом рассева в глу б ине и на п оверхности п итательной среды основанонамеханическом разъ единении
микроорганизмов, находящ ихся в исследу емом |
материале, с |
целью |
п олу чения изолированных колоний на п лотной |
п итательной |
среде. |
К оличество микроорганизмов, содерж ащ ееся висследу емом материале, п реду гадать заранее тру дно, п оэтому для п осевап ользу ю тся не одной, а
дву мя или тремя чаш ками. При очень б ольш ой |
б актериальной |
загрязненности материала рост микроб ов на п ервой |
чаш ке б ывает |
настолько гу стым, что п олу чить материал из отдельной колонии для выделения чистой ку льту ры невозмож но. Т огда для выб ора изолированных колоний п ользу ю тся второй чаш кой. Е сли ж е и наней колонии расп олож ены б лизко дру г к дру гу , б еру т чаш ку с третьим разведением.
Д лявыделениячистой ку льту ры п атогенных микроорганизмовчасто п ользу ю тся п осевом исследу емого материала на элективные и ингиб иторныеп итательныесреды.
За д а ниед л я вы по л нения л а бо р а т о р но йр а бо т ы
1.Рассмотреть нараздаточном материалехарактер ростаразличных
бактериальных ку льту р на п лотных и ж идких п итательных средах,
различные |
тип ы колоний, «п естрые» ряды б актерий |
с разной |
||
ф ерментативной активностью . |
|
|
|
|
2. О характеризовать выделенну ю ку льту ру (стаф илококка, киш ечной |
||||
п алочки) |
п о морф ологическим, |
ку льту ральным |
и б иохимическим |
|
свойствам. О ф ормить п ротокол. |
|
|
|
|
Т ема4.2. И Д Е Н Т И Ф И К А Ц И Я К У Л ЬТ У Р БА К Т Е РИ Й |
|
|||
И дентиф икацию выделенных |
б актериальных |
ку льту р |
п роводят |
п у тем изу ченияморф ологии б актерий, их ку льту ральных, б иохимических и дру гих п ризнаков, п рису щ их каж дому виду .
Кул ьт ур а л ьны епр изна ки. К у льту ральные свойствахарактерны для
каж дого вида микроорганизма и п отому являю тся |
важ ным |
диагностическим п ризнаком. |
|
Свойстваку льту ры изменяю тся с ее возрастом, п оэтому |
возраст |
ку льту ры необ ходимо у читывать и отмечать вп ротоколе исследования. В озраст ку льту ры, наиб олее б лагоп риятный для изу чения ее свойств, зависит от видовой п ринадлеж ности микроорганизма, так как для п оявления выраж енных п ризнаков роста различным микроорганизмам необ ходиморазноевремя. Н ап ример, колонии чу мной п алочки могу тб ыть
25
об нару ж ены и п одвергну ты изу чению через 10 - 12 часов, колонии б актерий ту б ерку лезатолькочерез нескольконедель отмоментап осева.
К данным п ризнакам относятся морф ологические особ енности колоний б актерий, характер ростанап лотных и вж идких п итательных
средах. |
|
К олонии различаю тся п о величине, ф орме, |
цвету , консистенции, |
конту ру края, стру кту ре и характеру п оверхности. |
По величине колонии |
могу тб ыть кру п ные(диаметр б олее4 - 5 мм), средние(2 - 4 мм) ималые(1 - 2 мм), п о ф ормекру глые, розеткооб разные, листовидныеи т. д. Ц вет колонии зависитотвыраб отки оп ределенногоп игмента- б елого, ж елтого,
красного и др. К олонии неп игментиру ю щ их |
б актерий б есцветны. По |
|
консистенции различаю тся су хие, |
влаж ные, |
сочные или слизистые |
колонии. Поверхность колонии |
б ывает |
гладкой, морщ инистой, |
исчерченной, п лоской, вып у клой, вдавленной. К рай колонии мож етб ыть
ровным, волнистым, б ахромчатым. |
К олонии могу т иметь |
аморф ну ю , |
|
зернисту ю , волокнисту ю вну тренню ю |
стру кту ру . |
|
|
Х арактер |
роста б актерий в чистой ку льту ре, выращ енной на |
||
скош енном п итательном агаре, мож етб ыть су хим, влаж ным, |
«п олзу чим» , |
||
складчатым, п игментированным. В |
ж идкой п итательной |
среде одни |
|
б актериальные |
ку льту ры даю т |
диф ф у зное п ому тнение, дру гие |
характеризу ю тсяп ридонным, п ристеночным ростом; некоторыеку льту ры об разу ю тп ленки нап оверхности среды, дру гиеосадок наднеп роб ирки.
|
Б ио химические |
пр изна ки. Биохимическу ю активность микроб ов |
||
изу чаю |
|
|
|
которые микроб ная |
т п о характеру |
и количеству тех ф ерментов, |
|||
клеткап роду циру ети выделяетвовнеш ню ю среду . В |
ж изнедеятельности |
микроб овф ерменты играю тб ольш у ю роль. О ни являю тсяоб язательными у частниками разнооб разных б иохимических реакций, леж ащ их воснове ф у нкций п итания, дыхания. К аж дый вид микроорганизмовп роду циру ет п остоянный длянегоп околичеству и качеству наб ор ф ерментов. Поэтому
исследование |
б иохимических |
свойств микроорганизма является |
|
об язательным |
п ри оп ределении |
их |
видовой п ринадлеж ности. Д ля |
диагностики |
микроб ов наиб ольш ее |
значение имеет оп ределение |
сахаролитических |
и |
п ротеолитических |
ф ерментов, активиру ю щ их |
||||
соответственнорасщ еп лениеу глеводовиб елков. |
|
|
|||||
1. Са ха р о л ит ические |
фер мент ы |
микр о о р га низмо в. |
Свойство |
||||
расщ еп лять |
у глеводы |
и высокоатомные сп ирты, |
которые п ринято |
||||
об ъ единять |
в одну |
гру п п у , |
имену ему ю |
сахарами, |
п рису щ е многим |
||
п атогенным |
микроб ам. |
Под |
действием |
сахаролитических |
ф ерментов |
||
б актерий «сахара» расщ еп ляю тся наальдегиды и кислоты. |
К онечными |
п роду ктами их расщ еп ленияявляю тсягазооб разныевещ ества: СО 2 и Н 2.
О тнош ение микроорганизмов к |
различным |
у глеводам |
сп ециф ично и |
|
п оэтому |
ш ироко п рименяется |
в б актериологической |
п рактике для |
|
диф ф еренциации различных видовиразновидностей б актерий. |
||||
Д ля |
об нару ж ения сахаролитических |
ф ерментов исследу ему ю |
ку льту ру б актерий засеваю т в п итательные среды Гисса, называемые
|
26 |
такж е «п естрым» |
рядом. Последний п редставляет соб ой ряд п роб ирок с |
п еп тонной водой, |
«сахаром» и индикатором (реактивА ндреде или В Р). |
К ороткий «п естрый» рядГиссасодерж итоб ычно5 п роб ирок: с глю козой, лактозой, маннитом, мальтозой и сахарозой. При некоторых исследованиях для б олееу глу б ленного изу чения б иохимических свойств выделенногомикроорганизмаисп ользу ю тдлинный«п естрый» рядГисса, в составкоторого наряду с п еречисленными у глеводами входят и дру гие «сахара»: ду льцит, сорб ит, ксилоза, араб иноза, крахмал, ину лин, гликоген и др.
Н азвание «п естрый» ряд об у словлено тем, что п од действием ф ерментоврасту щ его микроб аодни у глеводы остаю тся неизменными и, следовательно, цвет п итательной среды не изменяется, вто время как дру гиесахарарасщ еп ляю тся, об разу якислыеп роду кты расп ада, которые изменяю тцветиндикатораи соответственноцветп итательнойсреды.
Среды Гисса б ываю т ж идкими и п олу ж |
идкими. В п роб ирки с |
ж идкими средами Гиссадляоб нару ж ениягазов, |
являю щ ихсяконечными |
п роду ктами расп адасахаров, оп у скаю т«п оп лавок» , который п редставляет
соб ой тру б очку диаметром 0,5 |
- 0,7 см, зап аянну ю с одного конца. |
|
Поп лавок |
оп у скаю т зап аянным |
концом кверху , п ри стерилизации он |
п олностью |
зап олняется п итательной средой. При об разовании всреде |
газооб разных п роду ктовп оследние вытесняю т часть находящ ейся внем ж идкости, вследствие чего у зап аянной верху ш ки п оп лавкаоб разу ется возду ш ный п у зырек различной величины. В п олу ж идких средах Гисса газооб разованиеоп ределяю тп оналичию мелких п у зырьковвтолщ есреды
и стойкой п ены наееп оверхности. |
|
|
|
|
Т аким |
об разом, п ри изу чении |
сахаролитических |
ф ерментов; |
|
выделяемых |
микроорганизмами, у читываю т |
не только явление |
||
расщ еп лениятех или иных сахаровп окислотооб разованию , |
нои глу б ину |
|||
ф ерментативного п роцессап о наличию |
вп итательной среде конечных |
|||
газооб разных п роду ктоврасщ еп ления. |
|
|
|
|
Проб ирки с наб ором сред Гиссаставят вш тативводин ряд. Н а |
||||
каж дой п роб ирке надп исываю тназвание сахара, |
содерж ащ егося всреде. |
Н а1-й п роб иркекаж дого ряда, кроменазвания сахара, у казываю тномер
или вид исп ыту емой микроб ной ку льту ры. |
К у льту ру б еру т накончик |
п етли в очень неб ольш ом количестве и |
засеваю т п о об щ еп ринятой |
методике. При п ереносе п етли из п роб ирки с одной сахарной средой в дру гу ю п етлю об язательно п рож игаю т, а исп ыту ему ю ку льту ру б еру т заново. Ш тативс засеянными средами Гиссаставятвтермостатп ри37 или
43 °С взависимости от исследу емого материалаи цели исследования. После инку б ации в термостате у читываю т резу льтаты ф ерментации сахаров.
И зменениецветап итательной среды вп роб иркеоб означаю тб у квой К , что соответству ет об разованию в среде кислых п роду ктоврасп ада сахара. К ислотооб разование, соп ровож даю щ ееся п оявлением п у зырьков газавп оп лавкеили втолщ еп олу ж идкой среды, об означаю твп ротоколе
|
|
27 |
|
|
|
|
оп ыта б у квами К Г, где б у ква Г |
у казывает на расщ еп ление сахара с |
|||||
об разованием конечных газооб разных п роду ктовегорасп ада. |
|
|||||
2. |
П р о т ео л ит ические фер мент ы |
микр о о р га низмо в. |
Н екоторые |
|||
микроорганизмы п роду циру ю т |
и выделяю т |
во |
внеш ню ю среду |
|||
п ротеолитические ф ерменты - п ротеазы, |
катализиру ю щ ие расщ еп ление |
|||||
б елков. |
В резу льтате расщ еп ления |
молеку лы |
б елка |
об разу ю тся |
||
высокомолеку лярные п ромеж у точные п роду кты |
расп ада - п еп тоны, |
химическая п рирода которых изу чена недостаточно. Под действием п еп толитических ф ерментовп еп тоны всвою очередь расщ еп ляю тся на п олип еп тиды (соединениядву х или нескольких аминокислот) и отдельные аминокислоты.
Д лявыявленияп ротеолитических ф ерментовисследу ему ю ку льту ру засеваю т вп итательну ю среду , содерж ащ у ю тот или иной б елок. Ч ащ е всего для этой цели п рименяю т ж елатин, реж е - сверну ту ю лош адину ю сыворотку , коагу лированный яичный б елок, молокоили ку сочки вареного мяса.
Протеолитическая активность одного и того ж е микроб а п ри оп ределении ее на различных п итательных средах б у дет п роявляться неодинаково, что об у словливается сп ециф ичностью ф ерментов. Поэтому дляразных видовмикроб оврекоменду ю тп итательныесреды различного состава.
2.1. О пр ед ел ениепр о т ео л ит ическо й а кт ивно ст и микр о бо в на ж ел а т ине.
М ясо-п еп тонный ж елатин разливаю твп роб ирки столб иком п о 5 - 6 мл.
Посевп роизводят у колом, п огру ж ая п етлю |
с исследу емой ку льту рой в |
глу б ь п итательнойсреды доднап роб ирки. М |
икроб ы, сп особ ныерастип ри |
низкойтемп ерату ре, оставляю тстоять вкомнатеп ри20 - 22 °С. О стальные
п осевы инку б иру ю т в термостате п ри 37 °С. В месте с оп ытными п роб ирками втермостат ставят одну или две п роб ирки с незасеянным
ж елатином для контроля. При темп ерату ре 37 °С ж елатин п лавится, п оэтому п ослеинку б ации п роб ирки, выну тыеиз термостата, оп у скаю тна
30 - 60 |
мин. |
в холодну ю |
воду |
или ставят в холодильник. После |
|
засту дневания |
ж елатина в контрольных п роб ирках |
п ристу п аю т к |
|||
п росмотру |
роста и у чету |
изменений в п итательной |
среде оп ытных |
||
п роб ирок. |
Т ам, |
где п од действием ф ермента ж елатиназы п роизош ло |
|||
расщ еп ление б елков ж елатина, |
отмечается разж иж ение п итательной |
среды. Проб ирки, в которых п осле су точного инку б ирования среда
остается б ез |
изменения, оставляю т на 6 |
- 7 дней для еж едневного |
п росмотра. В |
п ротоколе исследования |
об язательно отмечаю т день |
п оявления п ризнаковразж иж ения среды. |
При регистрации резу льтатов |
у читываю тинтенсивность ростаи ф орму разж иж енияж елатиновой среды. Разж иж ениеж елатинау разных видовмикроб овп роисходитнеодинаково. Т ак, нап ример, различаю тп ослойноеразж иж ениеж елатина, п ри котором п оследовательно разж иж ается один горизонтальный слой задру гим в нап равлении сверху вниз. У некоторых видов б актерий отмечаю т
28
разж иж ениекратерооб разноес вогну тостью п оверхности вф ормечайного
б лю дца, воронкооб разное. |
Ш таммы, об ладаю щ ие высокой активностью |
|
ф ерментаж елатиназы, разж иж аю твесь столб ик ж елатина, |
находящ ийсяв |
|
п роб ирке. |
|
|
Н екоторые виды |
п атогенных микроб ов с |
выраж енной |
п ротеолитической активностью об ладаю тсп особ ностью расщ еп лять б елок и п еп тон до п роду ктов глу б окого расп ада: индола, сероводорода,
мочевины и аммиака. При |
оп ределении видов и |
диф ф еренциации |
||
разновидностей |
п атогенных |
микроб ов наиб ольш ее |
значение |
имеет |
выявление дву х |
п ервых п роду ктов: индола и сероводорода. |
И ндол |
об разу ется из слож ной гетероциклической аминокислоты - трип тоф ана. Сероводород является конечным п роду ктом расщ еп ления аминокислот: цистина, цистеинаи метионина, содерж ащ их всвоем составесеру .
2.2. О пр ед ел ение инд о л а в кул ьт ур е (П о М о р ел ю). Д ля выявления индолооб разования засеваю т п етлю исследу емой ку льту ры микроб а в М ПБ, п риготовленный на п ереваре Х оттингера, содерж ащ ем б ольш ое количество своб одного трип тоф ана. Т отчас ж е п осле п осева п олоску индикаторной б у маги, п роп итанну ю раствором щ авелевой кислоты, оп у скаю твп роб ирку так, чтоб ы онанеу п алавп итательну ю среду и не
касалась б ы ееп оверхности. Д ляэтоговерхню ю |
треть б у маж ной п олоски |
||||
п ринимаю т п роб кой к |
горлыш ку |
п роб ирки. |
Посевы инку б иру ю т в |
||
термостате 24 - |
48 часовп ри 37 |
°С. О б разование индолавб у льоне |
|||
соп ровож дается окраш иванием |
ниж него концаиндикаторной б у маги в |
||||
слаб о розовый |
цвет, |
б олее |
заметный в п роходящ ем свете. Более |
||
чу вствительным |
индикатором |
на индол является реактив Э рлиха |
(сп иртовой раствор п арадиметиламидоб ензальдегидас хлороводородной кислотой). О п ределение п роводят следу ю щ им об разом: в п роб ирку с ку льту рой б актерий п риб авляю т 2 - 3 млэф ира, содерж имое энергично п еремеш иваю т и доб авляю т несколько кап ель реактива Э рлиха. О краш иваниеэф ирного слоявмалиново-красный цветсвидетельству ето п олож ительнойреакции наиндол.
2.3. О пр ед ел ение сер о во д о р о д а . Петлю исследу емой ку льту ры микроб ов
засеваю твп роб ирку |
с М ПБ или б у льоном Х оттингера. |
Т отчас ж еп осле |
п осева в п роб ирку |
вносят п роп итанну ю у ксу снокислым свинцом |
|
индикаторну ю б у магу |
наоп ределение сероводорода. В |
п олож ительных |
слу чаях об разу ю щ ийся вку льту ре сероводород всту п ает всоединение с б есцветным у ксу снокислым свинцом, п ревращ аясь всернокислый свинец, который п ридает индикаторной б у маге черно-б у рое окраш ивание. О б разованиесероводородаииндолавку льту реоп ределяю тодновременно. С этой целью вп роб ирку с засеянным б у льоном вносятодновременнодве индикаторные б у маги: на индол и сероводород. Д ля того чтоб ы индикаторныеб у маги неу п али вп итательну ю среду и некасались б ы ее
п оверхности, верхню ю треть б у маж ных п олосок |
п лотно п риж имаю т к |
стенке п роб ирки п роб кой. О кончательный |
у чет резу льтатов на |
об разование индолаи сероводородап роизводят на7 - 10-й день п осле
29
п роизведенного п осева, так как п роцесс ф ерментативного расщ еп ления б елкаи об разования конечных п роду ктоврасп адап роисходит иногдав
течениедлительноговремени. |
|
|
|
|
3. О кисл ит ел ьно -во сст а но вит ел ьны е фер мент ы . |
В ку льту ре |
|||
микроорганизмов |
могу т |
б ыть |
об нару ж ены |
окислительно- |
восстановительныеф ерменты, связанныеглавным об разом с дыхательной
ф у нкцией. |
|
|
|
|
|
|
3.1. Дл я вы явл ения фер мент о в д егид р а зи о пр ед ел ения их |
а кт ивно ст и в |
|||||
п рактике |
микроб иологических |
исследований |
п редлож ен |
метод, |
||
основанный на введении в п итательну ю |
среду |
органической |
краски, |
|||
вып олняю щ ей роль акцеп тора водорода. |
В резу льтате п рисоединения |
|||||
водорода краситель восстанавливается, |
п ревращ аясь |
в б есцветное |
||||
соединение, |
называемое лейкоб азой. Последнее п ри об ильном досту п е |
|||||
кислородамож етвновь окислитьсяи п риоб рести свойп реж ний цвет. |
||||||
В качестве акцеп тора водорода исп ользу ю т метиленову ю |
синь, |
|||||
лакму сову ю |
настойку , малахитову ю |
зелень, индигокармин, нейтральроти |
др. Д лявыявленияреду циру ю щ их свойствмикроб ау казанныекрасители доб авляю тк об ычным п итательным средам: М ПБ, М ПА , молоку .
О дин и тотж евидмикроб аведетсеб янеодинаковоп оотнош ению к краскам разного состава. Э то свойство микроб а исп ользовано в микроб иологической п рактике вкачестве диф ф еренциального п ризнака. Бактерии б рю ш ного тиф а реду циру ю т метиленову ю синь, но не реду циру ю т лакму саи не изменяю т нейтральрот вп ротивоп олож ность
киш ечной п алочке, которая |
остается |
нейтральной в отнош ении |
метиленовойсини, новосстанавливаетлакму с и нейтральрот. |
||
3.2. О пр ед ел ение фер мент а |
ка т а л а зы . |
Н екоторые микроорганизмы, |
п ринадлеж ащ иек гру п п еаэроб ов, вп роцесседыханияоб разу ю тп ерекись водорода, являю щ у ю сяклеточным ядом. К оличествоп ерекиси водородав ку льту ре никогдане достигает высоких концентраций, так как п о мере об разованияп ерекись разлагаетсянаводу и молеку лярный кислород п ри
у частии ф ерментакаталазы. |
|
|
|
О п ределением наличия каталазы |
наряду |
с изу чением |
дру гих |
б иохимических п ризнаков п ользу ю тся |
п ри |
оп ределении |
вида и |
диф ф еренциации разновидностей п атогенных микроб ов, выделенных из организмаб ольного и об ъ ектоввнеш ней среды. Н ап редметное стекло наносяткап лю 1 - 3 % растворап ероксидаводородаивносятвнееп етлю с б актериальной ку льту рой. К аталаза разлагает п ероксид водорода на
кислород и воду . В ыделение п у зырьковО 2 свидетельству ето наличии у данноговидаб актерий ф ерментакаталазы.
В б актериологической п рактике иногдаограничиваю тся изу чением сахаролитических и п ротеолитических п ризнаковисследу емых б актерий, если это является достаточным для их идентиф икации. В необ ходимых слу чаях п роводят изу чение дру гих п ризнаков, нап ример сп особ ности к восстановлению нитратов, карб оксилированию аминокислот, об разованию оксидазы, п лазмокоагу лазы, ф иб ринолизинаи дру гих ф ерментов, атакж е
30
оп ределение антигенной стру кту ры, чу вствительности к ф агам, виру лентности ит. д.
В се этап ы выделения и идентиф икации чистой ку льту ры б актерии мож ноп редставить ввидесхемы:
Iэт а п Иссл ед уемы йма т ер иа л
1.М икроскоп иямазковили нативных п реп аратов.
2.Посевначаш ки Петри с п итательным агаром.
3.Посевнаэлективну ю среду .
4.Посевнадиф ф еренциально-диагностическу ю среду .
IIэт а п Х а р а кт ер ист ика изо л ир о ва нны х ко л о ний
1.М азок-окраскап оГраму илидру гим методом
дляизу ченияморф ологии клеток
иих тинкториальных свойств.
2.Посевнаскош енный п итательный агар илидру гиесреды длянакоп лениячистой ку льту ры.
IIIэт а п Х а р а кт ер ист ика р о ст а кул ьт ур ы
1.М азок-окраскап оГраму илидру гими методами дляп роверки однородности ку льту ры.
2.Пересевнасреды «п естрого» ряда длявыявленияб иохимических п ризнаков.
3.Серологическиереакции дляизу чения антигенных свойств.
4.Зараж ениеи вскрытиелаб ораторных ж ивотных дляоп ределениявиру лентности.
П р имеча ния. 1. И сследу емый материал п еред п осевом |
с целью |
|
освоб ож дения от |
соп у тству ю щ ей микроф лоры иногда п одвергаю т |
|
нагреванию до 80 |
°С для выделения сп орооб разу ю щ их |
б актерий, |
об раб откекислотой – длявыделениякислотоу стойчивых б актерий и т.п . 2. У словияинку б ации п осевовзависятотф изиологических особ енностей
б актериальной ку льту ры, п оэтому аэроб ные б актерии выращ иваю т в п рису тствии кислородавозду ха, анаэроб ные б актерии – б ескислородной среде: некоторые б актерии лу чш е расту т п ри п овыш енном содерж ании
СО 2.