6 курс / Гастроэнтерология / Helicobacter_pylori_и_хеликобактериоз_Саторов_С_

акционного раствора (от 0,05 до 0,4 мг/л индикатора с цветовым переходом в области значений рН от 6,0 до 9,0). В качестве реакционного раствора применяются феноловый красный (рН перехода от 6,8 до 8,4), бромтимоловый синий (рН перехода от 6,0 до 7,6), нейтральный красный (рН перехода от 6,8 до 8,4), бромкрезоловый синий (рН перехода от 6,8 до 8,4), дигидрофосфат натрия, гидрофосфат калия (суммарно от 1,5 до 3,0 г/л), хлорид аммония, хлорид натрия (калия) от 0,01 до 0,05 г/л суммарно. С целью увеличения срока хранения в раствор можно дополнительно внести в качестве компонента гидроокись серебра или другие соединения серебра. Для приготовления раствора лучше использовать воду, прошедшую специальную обработку и кондиционирование озоном.

Для постановки анализа ампулу достают из упаковки и вскрывают. Затем в ампулу помещают биоптат и фиксируют время появления малиновой окраски (индикатор феноловый красный). Контрольное время составляет 15 мин, 3 ч. и 24 ч. Если окраска изменилась за первые 15 мин., то тест следует считать резко положительным, за 3 ч. – положительным; от 3 до 24 ч. – неоднозначным. Отсутствие изменений цвета в течение более, чем 24 часа говорит о несомненном отсутствии Helicobacter pylori в тканях биоптата.

К недостаткам уреазных тестов всех инвазивных методов диагностики, можно отнести риск и дискомфорт для пациента при проведении ФГДС и взятии биоптата, возможность получения неинфицированных биоптатов вследствие мозаичности колонизации слизистой оболочки желудка, образования колоний в складках слизистой оболочки, вне места взятия материала.

4.3. Гистологический метод

Гистологический метод основан на микроскопическом исследовании парафиновых срезов, с применением специального окрашивания по УортинуСтарри, Гимзе или Генте. Warren J. и Marschall В. предложили оригинальную окраску серебрением по методу Уортина-Старри, но эта окраска неспецифична, дорога и дает около 30 % ложноотрицательных результатов. Окраска Н.pylori по методу Гимза дает 21 % ложноотрицательных результатов.

Для быстрой диагностики Н.pylori в течение 5-7 мин. можно воспользоваться окраской генцианвиолетом. В соответствии с Сиднейской классификацией (1990 г.) Н.pylori определяются в виде мелких, прямых, слегка извитых палочек, находящихся в просвете желез в непосредственной близости от собственной соединительнотканной пластинки слизистой оболочки на поверхности эпителиальных клеток (рис. 21).

Рис. 21. Н.pylori в слизистой желудка. Окраска по Романовскому-Гимзе

При изучении Н.pylori в гистологических или цитологических препаратах можно выделить три степени обсеменения слизистой оболочки (количество микробных тел в поле зрения при увеличении 630):

1.слабая степень – до 20;

2.средняя степень – до 50;

3.высокая степень – более 50.

Следует помнить, что эффективность гистологической диагностики во многом зависит от квалификации морфолога и его опыта работы.

Преимуществами гистологического метода являются широкая доступность, удобства транспортировки и хранения исследуемых препаратов. Недостатками метода можно считать сложность обнаружения Н.pylori при низкой обсемененности, субъективизм специалиста, а также возможность присутствия на поверхности слизистой оболочки других видов спиралевидных микроорганизмов.

Результаты гистологического исследования могут свидетельствовать о наличии и степени обсемененности Н.pylori, также об имеющемся патологическом процессе, его тяжести, остроте и значимости для больного [188].

4.4. Cерологические методы

Иммунологические методики основаны на выявлении антител классов IgG, IgA в крови и секреторных sIgA в слюне и желудочном соке. Колонизация H.pylori вызывает системный иммунный ответ. Через 3-4 недели после инфицирования в слизистой оболочке и в крови больных появляются антитела к H.pylori. Они определяются методом иммуноферментного анализа (Л.В. Кудрявцева, 1999).

Классический иммуноферментный анализ (ИФА) с количественным определением в сыворотке или плазме крови больных антигеликобактерных антител разных классов характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью.

Кратко протокол исследования состоит в следующем. В лунки, сенсибилизированные антителами барана против IgG человека, добавляют 100 мкл неразведенной сыворотки и инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Затем после 3-кратной промывки буфером в каждую лунку добавляют 100 мкл комплекса антигена с биотином и вновь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. В эти же лунки, не удаляя предыдущий реагент, добавляют 100 мкл комплекса стрептавидин-пероксидаза и инкубируют при температуре 20 минут. Лунки промывают 5 раз буфером. В каждую лунку добавляют 100 мкл раствора субстрата (триметил бензидин и Н2О2) и инкубируют в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре, а затем останавливают реакцию путѐм добавления в лунки 50 мкл 2н. раствора HCI. Если через 4 недели после окончания терапии значение титра уменьшается на 20 % и более по сравнению с исходным, считают, что в результате лечения наступила эрадикация H.pylori. Если же значение титра не изменяется или уменьшение его составляет менее 20 %, то это расценивают как отсутствие эрадикации.

4.5. Метод полимеразной цепной реакции

Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК и комплементарного дополнения обеих цепей ДНК. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках – коротких двунитевых участках. Суть метода заключается в том, что, маркировав такими блоками специфический только для данного вида участок ДНК, можно многократно воспроизводить (амплифицировать) именно этот участок.

Для того чтобы осуществить такой процесс в пробирке, используют две генетические пробы, называемые праймерами, которые и служат в качестве затравки для синтеза выбранного участка ДНК.

Для постановки ПЦР и выявления основных генов патогенности H.pylori используются различные праймеры.

При внесении в исследуемую пробу праймеры подобно паре генетических детективов «прочѐсывают» раствор в поисках участка, которому они комплементарны и, следовательно, способны присоединиться, образовав двунитчатый стартовый участок. После присоединения (отжига) праймеров начинается воспроизведение с помощью фермента Таg полимеразы специфического участка ДНК. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации – это и есть цепная реакция в ПЦР. В результате количество копий фрагмента увеличивается в геометрической прогрессии, через 25 циклов амплификации синтезируются 106 степени копий фрагмента. В течение 30-40 циклов вырабатывается достаточное количество ДНК, чтобы учитывать результаты реакции после электрофореза в агарозном геле. ПЦР позволяет осуществить амплификацию в пробирке при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы из 4 дезоксинуклеозид-трифосфатов, являющихся структурными элементами всякой ДНК и коротких олигонуклеотидных 20-30-член- ных затравок (праймеров), комплиментарных 3-концевым последовательностям антипараллельных цепей ДНК гена. Повторяя 3 стадии 30-35 раз, за 2- 3 часа получают миллионы копий специфического участка ДНК вируса, бактерий или клеток крови.

исследователь B. Marshall, выпив культуру H.pylori, выделенную от пациента, с хроническим гастритом, вызвал у себя гастрит, подтвержденный гистологическими и морфологическими исследованиями.

Анализируя данные литературы, посвященные патогенетическим механизмам заболеваний, вызываемых H.pylori, можно заключить, что патогенез и проявление клинических признаков патологии данного генеза обусловлены морфологическими особенностями и способностью возбудителя содержать или синтезировать достаточно большое количество токсических продуктов.

Результаты исследований, проведенных специалистами в различных странах мира показывают, что штаммы H.pylori обладают высокой ферментативной и цитотоксической активностью. В то же время, имеются сообщения о выявляемости штаммов из биоматериалов с низкой способностью синтезировать фермент уреазу или содержать другие цитотоксические компоненты. На наш взгляд, это связано видимо с качеством индикаторных сред или зависит от квалификации специалистов лабораторий в различных научных центрах.

Данные, полученные многими учеными, а также результаты наших исследований свидетельствуют о некотором различии в генотиповой структуре H.pylori, полученных из биоматериала больных с гастродуоденитами, ЯБЖ и ЯБДК. Так, при гастродуоденитах, в отличие от больных с ЯБДК и ЯБЖ, генотип из вариации 6 хромосомных генов не обнаруживается. Если при язвенных патологиях, значительно чаще встречается генотип состоящий из ассоциации 4-х генов, то при гастродуоденитах, преимущественно обнаруживается генотип с наличием 3-х генов (ureB, ureC, cagH) в хромосоме.

В данном контексте, следует отметить, что штаммы H.pylori, как один из этиологических агентов гастродуоденальной патологии, характеризуются достаточно широкой генотиповой разновидностью. Во многих наблюдениях проявление симптомов и их интенсивность напрямую зависят от наличия и количества хромосомных генов, кодирующих основные факторы патогенности и вирулентности этих бактерий. В частности, ДНК, обнаруженные у больных с язвенной болезнью, характеризуются содержанием большого ко-

личества генов по сравнению с микроорганизмами, лежащими в основе этиологических факторов гастродуоденитов.

Колонизация Н.pylori в желудке или двенадцатиперстной кишке сопровождается системным иммунным ответом со стороны организма человека. Примерно через 3-4 недели после инфицирования у больных выявляются антитела к Н.pylori: IgG, IgA, IgM-классов в крови, а также секреторные sIgA, sIgM в слюне и желудочном соке.

При этом необходимо отметить, что при постановке диагноза патологии хеликобактерной природы концентрация анти-H.pylori IgG, равная 20 ед./мл в сыворотке крови не является диагностически значимым титром. На наш взгляд, информативными и диагностически значимыми при хеликобактериозе являются титры антител свыше 60 ед./мл.

Результаты наших исследований, дают основания заключить, что при нарастании титров специфических антител повышается и концентрация общего иммуноглобулина класса IgG в сыворотке крови, т.е. при воспалительном процессе хеликобактерной природы в защите организма наряду со специфическими антителами особое место принадлежит общим иммуноглобулинам, в частности, иммуноглобулинам класса G.

Эпидемиология хеликобактериоза является ключевым разделом патологии хеликобактерной природы. Данные научной литературы свидетельствуют о неравномерном распространении хеликобактериоза в различных странах в зависимости от пола, возраста и т.д. Наши исследования показали, что частота H.pylori-позитивных больных с заболеваниями ЖКТ среди женщин и мужчин находится на одном уровне. Здесь, следует отметить, что наши результаты не совпадают с результатами других авторов, так как одни исследователи указывают на наибольшую частоту хеликобактериоза у мужчин, а другие – у женщин.

Анализ данных научной литературы позволяет заключить, что первичное инфицирование человека H.pylori чаще всего происходит в раннем детстве. Распространенность H.pylori-инфекции в различных странах мира неодинакова и варьирует в больших пределах. В частности, в Российской федерации удельный вес данной инфекции составляет 60-70 %, что значитель-

но превышает этот показатель в США, Бельгии и Италии, т.е. в странах с высоким уровнем жизни.

Наши исследования показали, что инфицированность населения Республики Таджикистан бактериями Helicobacter pylori намного ниже, чем населения других стран, и обсемененность этими бактериями имеет свои возрастные особенности. Наиболее часто эти микроорганизмы обнаруживаются у пациентов в возрастной группе 15-19 лет, что необходимо учитывать при проведении лечебно-профилактических мероприятий.

В целом, прослеживается зависимость высокого риска инфицирования населения от уровня санитарной культуры, этнических особенностей, соци- ально-бытовых условий жизни.

БИ Б Л И О Г РА Ф И Ч Е С К И Й С П И С О К

1.Абдулхаков Р.А. Распространенность Helicobacter pylori // Казанский медицинский журнал. – 2002. – Т. 83, № 5. – С. 365-367.

2.Агеева Е.С., Штыгашева О.В., Рязанцева Н.В. Характеритсика факторов патогенности H.pyloriпричина социально-значимых заболеваний // Актуальные проблемы медицины: материалы 15-й Межрегиональной науч- но-практической конференции с международным участием, г. Абакан, 2526 апреля 2012 г.

3.Аруин Л.И. Helicobacter pylori: каким образом один возбудитель вызывает разные болезни / Л.И. Аруин // Эксперим. и клин. гастроэнтерол. –

2004. – № 1. – C. 36-41.

4.Аруин Л.И. Из 100 инфицированных Helicobacter pylori рак желудка возникает у двоих. Кто они? / Л.И.Аруин // Эксперим. и клин. гастроэнтерол. – 2004. – № 1. – С. 12-18.

5.Аруин Л.И. Классификация хронического гастрита / Л.И. Аруин, А.В. Кононов, С.И. Мозговой // Актуальные вопросы патологической анатомии: Материалы III съезда Рос. общества патологоанатомов. – Самара, 2009. – Т. 1. – С. 5-8.

6.Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. – М.: Триада-Х, 1998.

7.Бабак О.Я. Современные представления об оценке риска развития и

профилактике рака желудка / О.Я. Бабак // Сучас. гастроентерологія. – 2009. –

№6. – С. 62-66.

8.Бунова С.С. Методы диагностики инфекции Helicobacter pylori: современное состояние вопроса // Молодой ученый. – 2012. – № 12. – С. 540-543.

9.Вартанова Н.О. Культивирование, уреазная активность и белоксодержащие антигены Helicobacter pylori: автореф. дисс. … к.б.н. – Москва,

2005.

10.Войницкий А.Н., Лебедев Н.Н., Кузьмин-Крутецкий М.И. и др. Диагностика H. pylori быстрым уреазным тестом у больных с хроническими заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. – 2001. – Т. 11, № 2 (прил. 13). – С. 27.

11.Генотипирование клинических штаммов H. pylori в России / К.Т. Момыналиев [и др.] // Вестник РАМН. – 2003. – Т. 6. – С. 33-38.

12.Довгаль С.Г. Методы лабораторной диагностики хеликобактериоза // Акт. пробл. инф. патол. – СПб., 1993. – Ч. 1. – С. 21.

13.Домарадский И.В. Вопросы патогенности Helicobacter pylori // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2001. – № 2. – С. 45-47.

14.Доморадский И.В. Вопросы патогенности Helicobacter pylori / И.В. Доморадский // Рос. журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. – 2001. – Т. 11. – № 2. (прилож. 13). – С. 113.

15.Захарова Н.В. Helicobacter pylori-ассоциированные хронические гастриты (патогенез, возможности дифференциальной терапии): дисс. … докт. мед. наук. / Н.В. Захарова. – Санкт-Петербург, 2009. – 261 с.

16.Исаева Г.Ш., Бурханов Р.Р., Ефимова Н.Г., Селькова Е.П. Мониторинг HELICOBACTER PYLORI инфекции в Казани // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 12 (часть 2). – С. 270-273.

17.Исаева Г.Ш., Муравьев В.Ю. Распределение генотипов Helicobacter pylori в республике Татарстан // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. – 2008. – № 1. – С. 11-15.

18.Исаков В.А. Молекулярно-генетические основы патогенности Helicobacter pylori / В.А.Исаков // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопрактол. – 2002. – Т. 12, № 6. – С. 82-86.

19.Исаков В.А. Молекулярно-генетические основы патогенеза заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori / В.А.Исаков // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопрактол. – 2001. – Т.11, № 3 (прилож. 13). – С. 37-43.

20.Кириллов В.А. Факторы персистенции Helicobacter pylori. – М., 2005.

21.Кишкун А.А. Современные методы диагностики и оценки эффективности лечения инфекции, вызванной Helicobacter pylori (обзор литературы) // Клиническая Лабораторная Диагностика. – 2002. – No 8. – С. 41-46.