6 курс / Гастроэнтерология / Helicobacter_pylori_и_хеликобактериоз_Саторов_С_

«щелочное облако» вокруг H.pylori (И.В. Домарадский, 2001; Н.О. Вартано-

ва, 2005; В.А. Кириллов, 2005).

По мнению В.А. Исакова, 2002; K.A. Eaton at al., 1995; F. Bermejo, 2002,

а также большинства других исследователей, патогенетическое значение уреазы обусловлено тем, что ион аммония, образующийся из аммиака под воздействием этого фермента, оказывает токсический эффект на эпителиальные клетки желудка. Аммиак, образовавшийся в просвете желудка под воздействием уреазы, оказывает токсическое действие на стенку фагоцита, а при сочетанном воздействии ещѐ одного фермента H.pylori – каталазы, снижается активность нейтрофилов макроорганизма по отношению к микроорганизмам и замедляется ответная воспалительная реакция.

Имеются данные, что штаммы, выделенные у пациентов с раком желудка, характеризуются более высокой уреазной активностью в отличие от штаммов, изолированных от пациентов без рака желудка (E. Lydia, at al., 2010; Kh. Shorena at al., 2012).

В патогенезе хеликобактериоза немаловажную роль играет фермент муциназа, которая, располагаясь на поверхностной мембране, эффективно разрушает белок-муцин, обеспечивающий вязкость слизи. Таким образом, хеликобактер, защищая себя от бактерицидного действия соляной кислоты, проникает в защитный слой на поверхности эпителия желудка (Л.В. Кудрявцева и соавт., 2004).

Другие факторы патогенности – протеаза и фосфолипаза – способствуют нарушению целостности надэпителиальной слизи и позволяют микробам свободно распространяться по слизистой желудка. В патогенезе хеликобактериоза важное место занимают гемолизины, которые кодируются шестью хромосомными генами. Во время экспериментов путем клонирования этих генов было показано родство гемолизинов с групповыми антигенами крови человека Lewis b, которые взаимодействуют с эпителиальными клет-

ками слизистой оболочки желудка (Y.J. Yang at al., 2008; T. Ohno at al., 2011; T. Tohru at al., 2012).

Ключевую роль в патогенезе хеликобактериоза отводят цитотоксинам Н.pylori (Н.В. Захарова, 2009; Y. Yamaoka, at al., 1999; M.S. McClain, at al.,

2001; C. Figueiredo, 2001). Установлено, что цитотоксигенные штаммы секретируют полипептид р130. Причастность р130 к патогенности доказывается следующими факторами. Во-первых, больные язвенной болезнью в большинстве случаев инфицированы цитотоксигенными штаммами. Во-вторых, антитела к р130 задерживают in vitro вакуолизацию, вызванную фильтратами бульонных культур и целыми микроорганизмами. В-третьих, показано, что у пациентов, имеющих в крови антитела к полипептиду р130, чаще выявляют нодулярный гастрит и слизистая антрального отдела желудка у таких больных чаще инфильтрирована полиморфноядерными клетками (Л.И. Аруин и соавт, 1998; В.Д. Пасечников, 2004; S. Backert, 2008).

По мнению Э.А. Кондрашовой, (2002), H.pylori обладает относительно низкой иммуногенностью и обусловливает длительное взаимодействие микроорганизма с иммунной системой слизистых оболочек и персистенцию инфекции. У пациентов формируется состояние иммунологической толерантности (Л.И. Аруин, 1998). В то же время, по оценке В.А. Исакова, 1992; А.В. Кононова, 1999; M.J. Hornsby at al., 2008, CagA-протеин или цитоток- син-ассоциированный белок является высокоиммунногенным компонентом H.pylori и инициирует сывороточный IgG и местный sIgA-ответ. Достаточно высокой иммуногенностью обладает и фермент уреаза.

Разные штаммы H.pylori обладают неодинаковой способностью индуцировать воспалительный ответ, что связано с их антигенной характеристикой. У штаммов H.pylori выделены O-, H-, К- и поверхностные белковые антигены, против которых в организме вырабатывается специфические иммуноглобулины или антитела. Данные антитела участвуют в иммунной защите организма и имеют важное диагностическое значение.

Учитывая клиническую и диагностическую значимость специфических противохеликобактерных антител, нами был изучен уровень анти-H.pylori иммуноглобулинов класса G и общих иммуноглобулинов классов A, M и G в сыворотке крови у больных жителей Республики Таджикистан.

На базе лаборатории иммунологии Таджикского НИИ профилактической медицины было обследовано 1250 пациентов с гастродуоденальной патологией, т.е. с хроническим гастритом, гастродуоденитом, ЯБЖ и ЯБДК.

Как видно из табл. 6, анти-H.pylori антитела класса IgG были обнаружены в сыворотке крови у 82,8 % обследованных лиц.

Таблица 6

Результаты изучения концентрации анти-H.pylori иммуноглобулинов класса G методом ИФА

Показатели титра антител в сыворотке крови колебались в больших диапазонах: от 20 ед./мл до 120 ед./мл и более (табл. 7). Для большинства обследованных (60,7 %), эти показатели находились на уровне 20 ед./мл. Количество обследованных с концентрацией антихеликобактерных иммуноглобулинов класса G 60 ед./мл и более составляло всего 10,9 %. Для 28,4 % пациентов титр этих иммуноглобулинов был высоким – более 120 ед./мл.

Таблица 7

Распределение пациентов, инфицированных H.pylori в зависимости от уровня титра IgG к H.pylori

Нами были сопоставлены результаты серологического, эндоскопического и ПЦР исследований. Были обследованы 220 пациентов с выраженными клиническими проявлениями заболевания с положительными результатами ПЦР исследований, также с выраженной эндоскопической картиной заболевания.

Как видно из данных, представленных в табл. 8, у преимущественного большинства больных с гастродуоденальной патологией (82,7 %) наблюдались высокие титры (120 ед./мл и более) анти-H. pylori IgG в сыворотке крови. Титр 20-60 ед./мл только у 4,5 % больных. Для 12,7 % больных этот показатель составлял 60 ед./мл.

Таблица 8

Титры специфических антихеликобактерных антител у больных хеликобактериозом с выраженными клиническими признаками, эндоскопической картиной и положительным ПЦР-анализом

Следовательно, можно предполагать, что концентрация анти-H.pylori IgG равная 20 ед./мл в сыворотке крови, не является диагностически значимым титром при постановке диагноза патологии хеликобактерной природы. На наш взгляд, информативными и диагностически значимыми при хеликобактериозе являются титры свыше 60 ед./мл и, в основном, 120 ед./мл и более.

Корреляционная связь была выявлена между титром специфических антител и содержанием общих иммуноглобулинов (табл. 9). Так, при титре специфических антител 20 ед./мл содержание иммуноглобулинов класса А и M в сыворотке крови не превышало уровня 2,77 ед./мл. Однако содержание общего IgG колебалось в пределах от 0,54 до 10,1 международных единиц. При титре специфических антител 60 ед./мл и 120 ед./мл и более концентрация иммуноглобулинов класса А и М остаѐтся в пределах нормы. Однако наблюдается резкое повышение уровня общего IgG – до 24,61 ед./мл.

Таблица 9

Уровень Ig A, M и G у пациентов, инфицированных H.pylori, в зависимости от уровня титра IgG к H.pylori (n = 220)

Полученные результаты дают основание заключить, что при нарастании титра специфических антител повышается концентрация общего иммуног-

лобулина класса IgG в сыворотке крови. Следовательно, при воспалительном процессе хеликобактерной природы в защите организма наряду со специфическими антителами особое место принадлежит общим иммуноглобулинам, в частности, иммуноглобулинам класса G.

Генетическая характеристика Helicobacter pylori

На сегодня существуют различные подходы и методы типирования микроорганизмов. К современным эффективным чувствительным методам типирования микроорганизмов относятся генотипические методы, базированные на исследовании структуры ДНК (L. José и соавт., 2009; J.L. ProençaModena и соавт., 2009; B. Bjorkholm и соавт., 2009; H. Qiang и соавт., 2002).

Сущность этих методов состоит в том, что клонально родственные изоляты имеют определенную характеристику или признаки, посредством которых они могут быть дифференцированы от неродственных изолятов. Данные литературы, посвященные сравнительному анализу результатов исследования микроорганизмов, основанных на фенотипических и генотипических методах, позволяют заключить, что по большинству показателей фенотипические методы значительно уступают генотипическим. Это связано с тем, что возможности фенотипических методов ограничены вследствие способности микроорганизмов изменять экспрессию соответствующих генов.

Молекулярно-генетический анализ хромосомной ДНК и генотипирование H.pylori имеют как теоретическое, так и практическое значение. Важность представлений о распределении генотипов H.pylori при различных заболеваниях обусловлена тем, что установление генотиповой принадлежности штамма позволяет провести качественный мониторинг лечения заболеваний хеликобактерной природы. Например, на сегодня известно, что штаммы сagA оказывают более значимое воздействие на прогноз заболева-

ния, чем штаммы без cagA (T.M. Peters at al., 2001; M.L. Tomasini at al., 2003; K. George, at al., 2013). Штаммы с типом s1vacA чаще ассоциированы с заболеваниями желудка, чем штаммы s2vacA. Возникновение язвенной болезни двенадцатиперстной кишки значительно чаще связывают с babA2 штаммами H.pylori. В целом, эффективность лечения во многом зависит от гено-

типа H.pylori (S.Y. Kim и соавт., 2001). По данным многочисленных иссле-

дователей (J.L. van Doorn at al., 2000; A. Masao, 2002; S.Y. Kim at al., 2001; A.A. Ashour at al., 2001) три основных генетических маркера могут рассматриваться как специфические для заболеваний, ассоциированных с H.pylori. Они включают в себя гены cagA, vacA, iceA.

Несмотря на то, что клиническая значимость H.pylori при гастродуоденальной патологии установлена недавно, на сегодня накопилась достаточная информация о генетической особенности хромосомной ДНК этих бак-

терий (R.A. Aim, 1999; C. Pigueiredo at al., 2000; A. Dawn at al., 2001; L. Li at al., 2002). К настоящему времени у двух штаммов («J99» и «26695») H.pylori определены полные последовательности генома. Из 1630 генов 1587 кодируют белки, из которых свыше 60-ти отнесены к категории «патогенных генов». Штамм «J99» имеет 1643831 пару оснований, 1491 ген, из которых 1489 кодируют белки. Геномы «J99» и «26695» содержат по две копии 16S, 23S и 5S rRNA генов, а также плазмиды, содержащие гены антибиотикорезистентности. Оба штамма «26695» и «J99» демонстрируют генетические различия до 6 % нуклеотидов, что свидетельствует о высоком уровне внутривидового полиморфизма. Вместе с тем, по сравнению с другими кишечными бактериями, H.pilori являются относительно консервативными

(R.A. Alm at al., 1999).

С целью изучения генетической характеристики штаммов H.pylori, циркулирующих в Республике Таджикистан, и клинической значимости отдельных хромосомных генов в возникновении различных гастродуоденальных заболеваний, нами был проведен ПЦР-анализ хромосомной ДНК и генотипирование имеющихся в нашей коллекции штаммов. Штаммы H.pylori, верифицированные непосредственно в биопсийном материале, были проанализированы на присутствие ureB, ureC, cagA, cagH, vacS1 и vacS2 генов в хромосомной ДНК.

В таблице 10 приведены данные о наличии некоторых генов патогенности в хромосоме штаммов H.pylori, циркулирующих в Таджикистане. Как видно из данной таблицы, все проанализированные штаммы H.pylori (100 %), полученные от больных с различной гастродуоденальной патологией харак-

теризуются присутствием ureC (рис. 11) гена в хромосоме, т.е. являлись ureCгенотипом. О диагностической и клинической значимости данного гена для большинства штаммов H.pylori свидетельствует результаты исследования

S.K. Shukla at al., 2011; P.L. Andrey at al., 1995 и других авторов. В свою оче-

редь, А.А. Кишкун и соавт. (2001) сообщают о том, что частота обнаружения данного гена у штамм мов, полученных от больных с ЯБЖ, ЯБЖД и ХГ варьирует в больших диапазонах – от 60 % до 84,1 %. Гены ureA, ureB, ureC и ureI, кодирующие фермент уреазу, относятся к важным показателям патогенетой активности H. pylori и уреаза является собственно маркером инфекции H.pylori и фактором защиты микроорганизма от действия соляной кислоты. Она обеспечивает длительное персистирование H. pylori в желудке человека, усиливает воспалительные реакции посредством активации моноцитов, нейтрофилов, секреции цитокинов, образования свободных радикалов и окиси азота. Считается, что большая субъединица уреазы – UreB действует как аттрактант для лейкоцитов (рис. 12).

Таблица 10

Штаммы, подвергнутые ПЦР анализу и их генетическая характеристика

Рис. 12. Результаты ПЦР анализа на UreB ген

Ген cagA (cytotoxin-associatedgene) – кодирует соответствующий белок, который играет ключевую роль в патогенезе H.pylori-инфекций. Данный ген расположен в островке патогенности хромосомной ДНК H.pylori (Е.В. Ма-

каренко, 2004; A.A. Ashour at al., 2002; T. Yeganeh at al., 2008; B. Khansa и соавт., 2010; George K. at al., 2013).

Островком патогенности называют участки генома H.pylori, содержащего набор генов, при помощи которых происходит экспрессия систем, вырабатывающих медиаторы воспаления, и секреция веществ, ассоциированных с вирулентностью (M. Kivi at al., 2005; C. Nilssonat al., 2003). Ген cag (cag-

PAI) кодирует белки IV секреторной системы H.pylori, функция которой состоит в доставке эффекторных молекул микроорганизма в клетки макроорганизма. Они позволяют H.pylori модулировать метаболизм эпителиоцитов слизистой оболочки желудка, включая и экспрессию протоонкогенов (S. Backert и соавт., 2000; B. Gebertat al., 2003; E.T. Courtney at al., 2005).

Продукты генов, входящих в состав островка патогенности, способны переносить cagA непосредственно в эпителиоциты слизистой оболочки желудка, где он подвергается фосфорилированию. Фосфорилирование cagA внутри эпителиоцитов приводит к изменению их цитоскелета, в результате чего происходят морфологические изменения эпителиоцитов. Гены островка патогенности также принимают участие в модуляции экспрессии генов эпителиальных клеток, кодирующих митоген-активируемые протеинкиназы, ядерный фактор kB (NF-kB) и активирующий белок-1 (АР-1). Транскрипция гена интерлейкина ИЛ-8 эпителиоцитами слизистой оболочки желудка

также зависит от экспрессии ряда генов, входящих в состав островка патоген-

ности H.pylori (S. Maeda at al., 2000; J. Copps, 2009; L. Acacia at al., 2009).

Штаммы Cag + заставляют продуцировать IL-8 эпителиальные клетки

(M. Aihara at al., 1997; J.E. Crabtree at al., 1999; H. Junzo at al., 2008). Эти свойства, как было доказано ранее, зависят от двух генов, а сейчас ясно, что этих генов гораздо больше. На основании этих данных и сравнения генов cag-региона с известными генами других бактерий авторы пришли к заключению о том, что cag-регион кодирует 4-тип секретирующих систем, которые выделяют или позволяют экспрессировать протеины, взаимодействующие с эпителиальными клетками. Японская группа исследователей не подтвердила эти данные. Было установлено, что cag+ штаммы связаны с увеличением риска возникновения атрофического гастрита. Такие противоречивые данные могут свидетельствовать о том, что одного маркера патогенности недостаточно для проведения эпидемиологических исследований с целью выявления особенностей штаммов Н.pylori и связи их с различными нозологическими формами (Y. Weiminи соавт., 2004; M. Asaka и соавт., 1995).

При обследовании европейцев, страдающих язвенной болезнью, ген cagА был выявлен в 95-100 % случаев, а у больных с диспепсией без язвенной болезни в 66 % случаев (Т.В. Мишкина и соавт., 2007; К.Т. Момыналиев и соавт., 2003; M. Karen и соавт., 2011; F. Aydin и соавт., 2004). Исследования, проведенные у пациентов с подобными нозологическими формами в Юго-Во- сточной Азии и Латинской Америке при высокой инфицированности H.pylori, не выявили четкой закономерности, свидетельствующей о более или менее выраженной частоте выявления гена cagА при язвенной болезни и неязвенной диспепсии (J. Linda и соавт., 2008; H. Saribasak и соавт., 2004; H.I. Catalano и соавт., 2002; J.C. Gonzales-Valencia и соавт., 2000; D.Y. Graham, 1989).

Наши исследования показали, что частота встречаемости генов cagА и cagН (рис. 13) в хромосоме штаммов, полученных от больных с гастродуоденальной патологией не превышает 80 % (рис. 14). При этом, наиболее чаще встречалась ассоциация cagA+cagH – в 56,7 % случаев (рис. 15). Частота встречаемости гена cagH в хромосоме, без ассоциации составляла 36,7 %, а

ген cagA – 6,7 %.