(со скоростью к_х ) или привести к образованию продукта (со скоростью к2 ).
(Примечание: в некоторых источниках к2 обозначается как kcaV )
Из-за способности ферментов выступать катализаторами обратного про-
цесса Е и Р соединяются и обновляют комплекс (со скоростью к_2 ). Если на
обратную реакцию (,к_2) не обращать внимания, то интерпретировать данные становится очень просто. Но так можно поступать только в начале реакции, когда концентрация Р еще очень низкая. Предположение, что к_2 настолько мало, что им можно пренебречь, ведет к упрощению предыдущего уравнения
до следующего вида. |
|
|
к \— |
|
к2 >Е + Р, |
Е + S -J' |
> ES |
|
- |
|
|
Благодаря такому упрощению химики Леонор Михаэлис и Мод Ментен смогли описать кинетические свойства множества ферментов. Благодаря их
работе было получена формула, описывающая зависимость скорости катали-
тической реакции от концентраций фермента и субстрата, а также скоростей протекания индивидуальных реакций. Отправной точкой для него стало выра-
жение, устанавливающее отношение между скоростью реакции и концентра-
цией фермент-субстратного комплекса.
V = k2 [ES ].
Проще говоря, скорость образования ES составляет кх[£][£], а скорость рас-
щепления сравняется {к_х + k2 )[ES]. На протяжении всей реакции концентра- ция ES остается почти неизменной. Это сравнительноустойчивое предположе- ние, которое принимает в расчет, что во время реакции концентрация любых промежуточных продуктов практически не меняется. Такое предположение оз- начает, что скорость образования ES равняется скорости расщепления ES, или
4E][S ] = (*_, + к2 ) [£5].
В результате исходное уравнение приводится к следующему виду.
[ES]1 (*-.к+,*;) „
Сочетание трех констант скорости дает в результате новую постоянную —
константу Михаэлиса, Км, которая не зависит от фактической концентрации фермента и субстрата, однако связана с соотношением концентраций. По этой причине Км является важной характеристикой фермент-субстратного взаимо- действия. Через константу Михаэлиса можно выразить концентрацию ES.
lES] jm
км
120 ЧАСТЬ 2 Фундамент биохимии: белки
Когда концентрация фермента намного ниже, чем субстрата, значение [S]
становится очень близким к общей концентрации субстрата. Концентрация фермента, [Е], равняется общей концентрации фермента, [Е]г минус концен-
трация фермент-субстратного комплекса, или [Е] = [Е]Т - [£5]. Если подста-
вить это соотношение в предыдущее уравнение, то можно показать, что
км
Преобразование этого уравнения приводит к получению такой формулы.
[ |
, |
\ЕИК« |
[ |
Щ |
||
1 |
г -1- |
1 + [s] |
M |
- [5£]+ |
||
|
|
/^ |
|
|
|
|
При подстановке этого выражения в формулу V — k2[ES\ или ( V = kcat[ES ] ) |
||||||
можно получить: |
|
|
|
ы |
|
|
|
V = k2 [ E )T |
|
|
' |
||
|
|
|
[S ] + км |
|
Максимальная скорость реакции Fmax достигается, когда все молекулы фермента связаны с субстратом. То есть [ES ] = [Е ]т. Это позволяет заменить V = k2[ES ] на Fmax = k2[E ]T . Такая подстановка приводит к преобразованию
предыдущей формулы в уравнение Михаэлиса-Ментен.
v |
v^ [s] |
- |
[s]+ K M |
Это уравнение хорошо описывает данные, приведенные на рис. 6.9. При
очень низких концентрациях [S ] « Км, V ~ ( VmaJKX )[S ]. Если [S ] больше Км (высокая концентрация [S ]), то V = Kmax. Если [S ] = Км,то V = Ктах/2.
Идеальное приложение
Уравнение Михаэлиса-Ментен объясняет поведение многих ферментов. Значения Км и Vmax определяются относительно просто. Обычно эта задача за- ключается в анализе графика с помощью компьютерных программ, подбираю- щий наиболее подходящую кривую.
Значения Км варьируются в широких пределах. Значение зависит от при-
роды фермента и субстрата, а также от различий во внешних факторах таких,
как температура, сила ионного взаимодействия и уровень pH. Поскольку Км
обозначает концентрацию субстрата, необходимого для заполнения полови- ны активных участков фермента, его можно рассматривать как минимальную концентрацию субстрата, обеспечивающую должный уровень каталитической
ГЛАВА 6 Ферментативная кинетика: ускоряемся |
121 |
превышать этот лимит путем образования совокупностей. В таких группах
продукт одного фермента является субстратом для близко связанного фермен- та. Это позволяет субстрату проникать в группу и проходить от фермента к ферменту так, если бы он продвигался по конвейерной ленте. (Генри Форд гор-
дился бы таким достижением!)
Еще одна сложность состоит в том, что многим ферментам требуется боль-
ше одного субстрата. Чтобы задействовать множественные субстраты, приме- няется техника последовательного или двойного замещения. В последователь-
ном замещении весь субстрат должен одновременно связаться с ферментом
перед выходом продукта. В таком замещении порядок, в котором оно происхо-
дит, не играет особой роли. В двойном замещении, или попеременном взаимо-
действии перед полным связыванием субстрата образуется один или больше продуктов. Механизм двойного замещения временно модифицирует фермент.
И снова математика:графики Лайнувивера-Берка
Давным-давно, до изобретения компьютеров, нахождение Км и Fmax было
весьма нетривиальной задачей. Сегодня, программы по построению соответ-
ствующих кривых позволяют проводить анализ данных и определять целевые значения очень быстро. Тем не менее в биохимии существует относительно простой способ аналитического определения значений этих двух констант. Он заключается в построении графика Лайнувивера-Берка, также известного как
график двойной обратной зависимости. График основан на преобразовании
уравнения Михаэлиса-Ментен до следующего вида.
i = ikj_ + _L
У ГтахИ Ктах '
Построение графика Лайнувивера-Берка сопряжено с определенными труд- ностями. Одна из них состоит в том, что в предложенной процедуре умыш- ленно переоценивается низкая скорость взаимодействия субстрата. По этой причине небольшие погрешности в измерениях приводят к получению недо-
пустимо больших ошибок на графике. В результате такой график можно при-
менять только для получения общего представления о величинах Км и Ктах.
Современные компьютеры позволяют аппроксимировать данные в гиперболу с гораздо большей точностью.
Уравнение имеет форму у = тх + b и описывает линейную зависимость. График обратной величины скорости 1/ Кот обратной величины концентрации
субстрата 1/ [S ] представляется прямой линией, пересекающей ось ^ в точке
1/Fmax, а ось* — в точке -1/Км (рис. 6.10).
График Лайнувивера-Берка — это наиболее популярный графический
способ нахождения значений Км и Ктах. Тем не менее существуют и другие
ГЛАВА 6 Ферментативная кинетика: ускоряемся 123
методы. График Вулфа, показанный на рис. 6.11, строиться на основе такого
уравнения.
Ш |
+ |
V |
|
V V. |
|
max |
|
max |
|
|
w
max
M
Наклон = KM Vymax
m
Рис. 6.10. График Лайнувивера-Берка
11
[S]IV
Kjv1 ;max
M '
M
Наклон = \ / Vtmax
M ->
Puc. 6.11. График Вулфа
124 ЧАСТЬ 2 Фундамент биохимии: белки
Зависимость [S\!V от [S] также описывается линейным законом. В методе Иди-Хофсти строиться график (рис. 6.12) для следующего уравнения.
шах *
V
м
VI [S]
Рис. 6.72. График Иди-Хофсти
Как и в предыдущем случае, зависимость V от VI[S\ представляется прямой
линией. (Химики и математики просто обожают прямые линии!)
Ингибирование:подавлениеферментов
Ингибиторы — это вещества, которые снижают активность ферментов.
Они делятся на два больших класса: конкурентные ингибиторы, которые кон-
курируют с субстратом, и неконкурентные ингибиторы, которые соответствен-
но с ним не конкурируют. (Звучит как тавтология, но с этим ничего не поде-
лаешь — определения такие, какие есть.) Смешанные ингибиторы обладают
характеристиками как конкурентных, так и неконкурентных ингибиторов. (Не-
конкурентные ингибиторы очень специфичны и встречаются крайне редко.) В целом процессы носят обратимый характер, но существуют также необра-
тимые ингибиторы, которые значительно видоизменяют фермент или связь с ним на постоянной основе. Любое ингибирование служит для регуляции
ферментативной активности. У ингибирования широкая область применения
ГЛАВА 6 Ферментативная кинетика: ускоряемся 125
в медицине. Наиболее примечательными примерами выступают противоэпи- лептические средства и препараты химиотерапии, наряду с неизменно попу- лярной виагрой. Многие яды также действуют как ингибиторы.
Конкурентное ингибирование
Конкурентный ингибитор проникает в активное место фермента и таким образом предупреждает субстрат от входа в реакцию. Такая помеха приводит к
снижению числа формирующихся фермент-субстратных комплексов, а значит
уменьшает скорость катализа. В большинстве случаев часть ингибитора ими-
тирует участок субстрата. Увеличение концентрации субстрата перекрывает
это ингибирование, из-за чего увеличивается вероятность того, что в активное место проникнут молекулы субстрата, а не молекулы ингибитора.
Неконкурентное ингибирование
Неконкурентные ингибиторы не проникают в активные центры, но вместо этого связывают некоторые другие участки фермента. Такие вещества обыч-
но не имитируют субстрат. Этот вид ингибирования понижает число оборотов
фермента. В отличие от конкурентного ингибирования увеличение субстрата
не приводит к подавлению неконкурентного ингибирования. У этого вида ин-
гибирования имеется множество форм и не существует простой описательной
модели.
График ингибирования
Для изучения ферментного ингибирования строятся графики Лайнувивера-
Берка. На рис. 6.13 и 6.14 показано, как изменяется график в случае добав- ления неконкурентного и конкурентного фермента. По графику ферментного
ингибирования можно легко определить его класс. В неконкурентном фер-
ментном ингибировании значение Км остается неизменным. В случае конку- рентного ингибирования постоянной оказывается величина Vmax.
Регуляция ферментов
В общем случае нерегулированное увеличение концентрации субстрата приводит к повышению скорости реакции. Наряду с этим увеличение концен- трации продукта вызывает обратный эффект. Регуляция продукта выступает
способом контроля реакции по принципу обратной связи. Тщательное регули-
рование активности ферментов оказывается востребованным во многих случа- ях. Такое регулирование осуществляется четырьмя способами.
126 ЧАСТЬ 2 Фундамент биохимии: белки
Неконкурентное ингибирование
1/К
Без ингибирования
max
и
т
Рис.6.13. График Пайнувивера-Ьерка, иллюстрирующий неконкурентное
ингибирование
MV
Без ингибирования
Конкурентное ингибирование
1/Кшах
т-
Рис.6.14. ГрафикЛайнувивера-Берка, иллюстрирующий конкурентное
ингибирование
ГЛАВА 6 Ферментативная кинетика: ускоряемся 127
Глюкозооксидаза. Удаляет глюкозу из яичного порошка. Инвертаза.Стабилизирует сахара в конфетах с мягкой начинкой. Лактаза.Препятствует кристаллизации лактозы в мороженом.
Пектиназа.Очищает вино и фруктовый сок.
Каталаза
Удаляет Н202 при"холодной пастеризации"молока.
Протеазы
Алкалаза.Добавляется в моющие средства для удаления пятен белковой при-
роды.
Бромелин.Смягчает структуру мяса.
Фицин,стрептодорназа и трипсин.Применяются при обработке ран. Липаза.Способствует выделению сырного аромата Липоксигеназа.Отбеливает хлеб
Папаин.Смягчает мясо и стабилизирует пиво.
Пепсин.Применяется как пищевая добавка в готовой пище. Реннин.Применяется в производстве сыров.
ГЛАВА 6 Ферментативная кинетика: ускоряемся 129