четвертичную структуры некоторых белков. Особая роль принадлежит цистеину в ферментах, так как каталитическую часть активного центра составляют аминокислоты с гидроксильными и сульфгидрильными (цистеин) группами, т.е. ферментам без него никуда. Серосодержащие кислоты частично включаются в состав коферментов, например, цистеин позволяет КоА приобрести сульфгидрильную группу, через которую КоА связывается с субстратами. Особая роль метионина в метилировании, S-аденозинметионин является активным донором метильных групп, метилирование используется для регуляции генома, синтеза некоторых соединений (тот же самый адреналин из норадреналина или тимин из урацила, креатина из гуанидинацетата) и инактивации биогенных аминов, а также для конъюгации ксенобиотиков в печени для их обезвреживания.
На рисунке показан оборот метильной группы. Как вы видите, S- аденазинметионин, теряя метильную группу, превращается в S- аденозингомоцистеин, тот распадается на аденозин и гомоцистеин. Если у человека энзимопатия или авитаминоз B9 и/или B12, то гомоцистеин не превращается в метионин, вместо этого гомоцистеин накапливается в крови
– гомоцистеинемия.
В-седьмых, пищеварение детей. Новорожденные с молоком матери получают антитела, которые должны всасываться в кишечнике, а это значит, что вместе с ними могут всосаться пептиды, которые могут вызвать аллергическую реакцию. Некоторые белки расщепляются до пептидов, способных вызывать аллергические реакции и у взрослых в том числе.
101
Нуклеиновые кислоты
Половина этого раздела вам может показаться уже знакомой с занятий по биологии, и вы решите, что уже знаете тему, но это не так – практика показывает, что на семинарах студенты плохо воспроизводят данный материал, поэтому советую ознакомиться с данным разделом со всей серьёзностью и вниманием. Итак, приступим.
Начнём с характеристики нуклеиновых кислот и их химического состава. Это макромолекулы, гетерополимеры со строго определёнными последовательностью мономеров. Мономером выступают нуклеотиды. Нуклеиновые кислоты способны к формированию вторичных и третичных структур. Любая нуклеиновая кислота имеет 3‘-конец и 5‘-конец. Любая нуклеиновая кислота имеет регулярную часть (сахарофосфатный остав, одинаков на протяжение всей молекулы) и нерегулярную часть (азотистые основания, чередуются различные варианты). В плане химического состава: состояит из нуклеотидов, те состоят из азотистых оснований (аденин, гуанин
– пуриновые; урацил, тимин, цитозин – пиримидиновые), пентоз (пятиуглеродные мономерные углеводы – рибоза и дезоксирибоза), ортофосфаты. Подробнее о составе и строении поговорим в частных случаях. Нуклеиновые кислоты разделяются на ДНК и РНК – надо знать отличия: у ДНК есть азотистое основание тимин, а у РНК вместо него урацил; у ДНК дезоксирибоза (большая стабильность, защита от ферментов), а у РНК рибоза; ещё одно отличие – ДНК двуцепочечная, а РНК почти всегда одноцепочечная, но есть исключения (ретровирусы некоторые); ДНК всегда гораздо длиннее, чем РНК; последнее отличие – эти молекулы имеют разную пространственную организацию.
Как я и сказал, мономером нуклеиновых кислот является нуклеотид, что он из себя представляет? Если этот нуклеотид в составе ДНК, его принято называть дезоксирибонуклеотидом, если РНК, то рибонуклеотид. Дезоксирибонуклеотид (справа) имеет азотистое основание (аденин, гуанин, цитозин, тимин), связанное с дезоксирибозой (во 2-м положении отсутствует гидроксильная группа) посредством N-гликозидной связи, также имеется ортофосфорная кислота, связанная фосфоэфирной связью с 5-м углеродом
102
дезоксирибозы. Рибонуклеотид отличается одним возможным основанием (урацил, вместо тимина) и тем, что, вместо дезоксирибозы, просто рибоза. Нулеотид = азотистое основание + сахар + ортофосфат; нуклеозид = азотистое основание + сахар. Обычно нуклеотиды называют по типу «нуклеозид- сколько-то-раз-фосфат», например, аденозинмонофосфат. И раз уж мы заговорили о связях, то надо сказать, что нуклеотиды между собой связываются 3’-5’-дифосфоэфирной связью, она называется так, потому что ортофосфорная кислота связывается с двумя пентозами (так называют пятиуглеродные сахара) через 3-й и 5-й углероды. Это отмечено на рисунке.
Вот только имейте ввиду, что атомы углерода в сахаре номеруются цифрами со штрихом в обязательном порядке. И обратите внимание, что на фото представлен фрагмент ДНК – в 2’-положении нет гидроксильной группы. А ещё обратите внимание на то, что у любой цепочки нуклеиновых кислот есть 3’-конец с гидроксильной группой и 5’-конец с ортофосфатом, поэтому схематично цепи нуклеиновых кислот обозначают полосками с этими цифрами на концах (см. рисунок выше). Ну и последний тип связей, которые надо знать – водородные – образуются между полярными частями соответствующих азотистых оснований, эти связи необходимы для взаимодействия между двумя цепочками либо внутри одной цепочки. Пример образования водородной связи на рисунке.
103
Итак, вы должны хорошо знать строение нуклеотидов и нуклеозидов, связи внутри молекулы: фосфоэфирную, фосфодиэфирную, N-гликозидную, водородную.
Строение ДНК
Теперь перейдём к строению ДНК. Как я и говорил, её мономерами являются дезоксирибонуклеотиды. ДНК отличается очень большой длиной, имеет 3’-конец и 5’-конец. Первичная структура – полинуклеотидная (неразветвлённая) цепь. Вторичная структура – двухцепочечная правозакрученная спираль – она образуется за счёт водородных связей между азотистыми основаниями двух цепей (комплиментарное взаимодействие предполагает соответствие у азотистых оснований полярных группировок и числа циклов, т.е. пуриновое основание всегда соответствует пиримидиновому, чтобы в паре оснований было всегда три цикла и спирали ДНК всегда имели постоянный диаметр), в одном витке спирали 10 нуклеотидов. Обе нити ДНК антипараллельны и комплиментарны, т.е. идентичны, но перевёрнуты на 180 градусов. Третичная структура ДНК образуется за счёт накручивания её на белки-гистоны. Как это происходит? Гистоны H2A, H2B, H3, H4 объединяются в тетрамер, два тетрамера объединяются в октомер, на который накручивается спираль ДНК, делая вокруг октомера гистона 1,75 оборота (146 пар нуклеотидов), по всей длине ДНК располагаются эти гистоны (гистон, на который накручена ДНК, вместе называется нуклеосомой), но между нуклеосомами расположены небольшие участки ДНК (60 пар нуклеотидов), называемыми линкерными, их прикрывает гистон H1. Почему ДНК наматывается на гистоны? На поверхности гистонов очень много гистидина и аргинина, поэтому они положительно заряжены, а в ДНК очень много ортофосфатов, поэтому она отрицательно заряжена, вот плюс к минусу и притягивается. Надо сказать, что при взаимодействии с гистонами ДНК куда компактнее упаковывается в ядре, однако так она не доступна для ферментов репликации, репарации и
104
транскрипции, поэтому, если нужен доступ к ДНК, гистоны можно ацетилировать, метилировать, чтобы они потеряли полярность, или фосфорилировать, чтобы они теряли заряд – это мешает гистонам выполнять свою функцию – ДНК освобождается и становится доступной для ферментов. Не путайте ДНК и хромосому. Хромосома представляет собою одну молекулу ДНК (двуцепочечную), с которой связаны белки и немного РНК, т.е. это более сложная структура. Белки в составе хромосомы называются ДНКпротеинами, так как работают с ДНК-молекулой, они подразделяются на гистоновые и негистоновые. О гистоновых мы поговорили – их отличительная черта заключается в том, что они могут продолжительно связовать ДНК и отвечают за её структуру. А вот негистоновые белки связываются с ДНК лишь на короткий срок и отвечают за реализацию (транскрипцию) и обслуживание (репарацию) ДНК.
РНК
Теперь немного поговорим об РНК. Сначала обсудим виды. Три основных вида:
•рибосомальная,
•информационная,
•транспортная – помимо этих, есть ещё
•малая ядерная (участвует в сплайсинге),
•рибозимы (РНК с каталитической активностью – да-да, не только ферменты это умеют),
•интерферентные РНК (блокируют гены, комплементарным связыванием),
но мы обсудим только три основных вида.
Первичная структура у РНК такая же, как и у ДНК с разницей в составе нуклеотидов (рибонуклеотиды). У рибосомальной РНК вторичную структуру, как таковую не рассматривают – немного спирализуется (взаимодействие между азотистыми основаниями одной цепи), а вот третичная структура вполне внятная – комплекс рРНК с спец белками, в итоге получаются малые и большие субъединицы будущих рибосом – это третичная структура. Что касается информационной РНК, то она не спирализуется практически и всегда сохраняет первичную структуру, однако она подвергается ряду модификаций, которые мы разберём в теме посттранскрипционного процессинга. Транспортные РНК имеют вторичную структуру в форме листа клевера, это обусловлено тем, что некоторые основания взаимодействуют друг между другом, а некоторые минорные (изменённые), они прерывают спирализацию и придают правильную форму тРНК. После присоединения аминокислоты РНК приобретает третичную структуру в форме L.
105
С ДНК и РНК познакомились, теперь можно разобрать их функционирование. Начнём с репликации.
Репликация
Репликация – сложный ферментативный процесс по удвоению молекулы ДНК. Матрицей для синтеза новой (дочерней) ДНК служит старая (материнская) ДНК, в результате репликации в каждую молекулу ДНК (двуцепочечную) входит материнская и дочерняя цепочка, поэтому такую репликацию называют полуконсервативной (типа половина старая). Очень важно, что материнская цепь помечена, чтобы в случае исправления ошибок репликации репаративные системы знали, кто образец (мать). Очень важное новое понятие, которое вы должны усвоить – реакции матричного синтеза. В обычных ферментативных реакциях есть субстрат, фермент и продукт, а то, в какой продукт превращать субстрат, определял сам фермент, а в случае с матричным синтезом добавляется четвёртый элемент – матрица (в её роли выступают нуклеиновые кислоты), именно она определяет, в какой продукт фермент превратит субстрат – ключевое отличие. Зачем так? В обычных ферментативных реакциях один субстрат всегда превращается в один продукт – простая инструкция, которую можно заложить в фермент, но в матричных синтезах синтезируются разные и очень сложные продукты (длинные полинуклеотиды в строго определённых последовательностях), инструкцию по такой сложной работе в фермент не заложишь – слишком много информации, куда проще заставить фермент отталкиваться от образца
– матрицы. Теперь поговорим о том, как же протекает репликация.
Для репликации нам нужен доступ к азотистым основаниям, а они скрыты внутри двуцепочечной спирали, поэтому первым шагом нам надо как-то раскрутить ДНК. Что для этого делается? Фермент топоизомераза разрывает одну фосфодиэфирную связь, разрезая тем самым одну цепочку, и за один из концов разреза фермент цепляется, затем он немного раскручивает ДНК, там появляется пространство, в которое могут войти ДНКгеликазы (ферменты, которые продолжат раскручивание ДНК), после этого топоизомераза сшивает тот разрыв, что сделала, и уходит, т.е. её задачей было впустить в ДНК ферменты. Всё это визуализировано на рисунке выше.
106
Как же работают ДНК-геликазы? С помощью энергии АТФ они разрывают водородные связи между азотистыми основаниями и раздвигают их, а, чтобы азотистые основания не объединились вновь и вся работа ДНКгеликаз не пошла насмарку, SSB-белки (кружочки на рисунке) садятся на цепи ДНК, не давая им образовывать водородные связи с соседней цепью.
И вот после того, как цепи стали готовы, можно синтезировать новые. Этим занимаются ДНК-полимеразы, однако все они могут двигаться по матрице лишь от 3’-конца к 5’-концу, поэтому получается, что по одной цепи (синтезируется непрерывно, лидирующая) полимеразы с ДНК-геликазой будут двигаться в одном направлении, а по другой цепи – в противоположенных направлениях (в связи с этим она вынуждена синтезироваться фрагментами и называется отстающей цепью). Так вот начнём с лидирующей цепи.
Матрица движется от 3’-конца к 5’-концу, а сама дочерняя цепь растёт от 5’-конца к 3’-концу (антипараллельность). Сначала приходит альфа-ДНК- полимераза, она синтезирует РНК-праймер (10 рибонуклеотидов, комплиментарных ДНК, образуя что-то вроде гибрида), после этого она синтезирует уже ДНК (50 дезоксирибонуклеотидов), всё это по принципу комплементарности (аденин – тимин, гуанин – цитозин, для праймера аденин – урацил). Затем приходит дельта-ДНК-полимераза, она уже строит цепочку до самого конца. По ходу синтеза от ДНК отпадают SSB-белки. Примечательно, что для синтеза цепи ДНК используются дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ), от них отщепляется пирофосфат, высвобождая энергию, а оставшиеся
107
дезоксирибонуклеозидмонофосфаты включаются в состав цепи ДНК, т.е. одна молекула служит и строительным материалом, и источником энергии. Помимо этого, ДНК-полимеразы гидролизуют АТФ, чтобы двигаться вдоль ДНК. Выходит, что репликация крайне энергозатратный процесс.
Теперь разберёмся с отстающей цепью.
Её матрица идёт в обратном направлении, нежели лидирующая цепь и ДНК-геликаза, поэтому ДНК-полимеразы отстающей цепи вынуждены двигаться в обратную сторону. Вот освободился фрагмент цепи после ДНКхеликазы, на него садится альфа-ДНК-полимераза, начинает свою работу (так же, как и на лидирующей – 10 нуклеотидов праймера и 50 нуклеотидов чистой ДНК), а потом образуется после ДНК-геликазы образуется ещё фрагмент цепи, туда садится новая полимераза, и вот эти фрагменты ДНК обретут полностью дочернюю цепь только спустя какое-то время, в отличии от лидирующей, где постоянный синтез, т.е. они в буквальном смысле отстают. В отличии от лидирующей цепи, на отстающей после альфа-ДНК- полимеразы приходит эпсилант-ДНК-полимераза, а не дельта, но функция та же. На рисунке видно, что ДНК синтезируется фрагментами, называемыми фрагментами Оказаки. По ходу работы полимераз эти фрагменты достигают друг друга и сшиваются. По ходу синтеза ДНК SSB-белки так же отходят, как и от лидирующей цепи, субстраты и источники энергии те же.
В итоге, получается, что мы синтезировали дочерние ДНК, однако помните, что и в лидирующей, и в отстающей цепях были оставлены праймеры – РНК, вместо ДНК – их необходимо заменить на ДНК. Бета-ДНК-
108
полимераза вырезает праймеры, а на образовавшейся бреши выстраивает цепь ДНК, вот только этот фермент не может образовать фосфодиэфирную связь между нуклеотидом около бреши и последним нуклеотидом в бывшей бреши – особенности конструкции фермента – образует связи только с одного конца субстрата. Потом приходит ДНК-лигаза, которая сшивает эти несшитые связи. Всё, готово. Однако есть интересное дополнение. Как я и говорил, молекула ДНК очень длинная (измеряется в сантиметрах, в то время, как другие молекулы – в нанометрах и пикаметрах), если на ней будет всего две вилки, нам придётся проводить репликацию нереально долго. Репликационная вилка – фрагменты ДНК до и после ДНК-геликазы – напоминает двухзубую вилку, отсюда и название (см. рисунок).
Обычно в ДНК проникают по две ДНК-геликазы, образуется две вилки – это называется репликационным глазком (см. рисунок ниже), чтобы репликация прошла быстро, этих репликационных глазков делается очень много, а участок ДНК между соседними местами инициации транскрипции называются репликонами. На рисунке схематично показано, как движутся ДНК-геликазы, идёт репликация, разрастаются глазки, сливаются и репликация кончается.
109
Репарация
Теперь поговорим о репарации. ДНК – крайне важная молекула, очень большая, сложная и находится в крайне ограниченном количестве в клетке. Все молекулы имеют свойство повреждаться, если это происходит, то их репарируют, либо уничтожают, а на смену приходят новые молекулы. Правда репарируют обычно то, что «ломается» физиологически нормально.
В общем суть в том, что если у вас повредился белок, то вы спокойно можете его разрушить и синтезировать новый, отталкиваясь от генов, а этих белков у вас миллионы и миллиарды и синтезируются они чуть ли не за секунды, но в основном за минуты. А с ДНК вообще не прокатит так. Если вы разрушите 1000 молекул белка и только спустя какое-то время замените их новыми, то на фоне миллиарда этих белков потеря будет незаметной. А молекул ДНК у нас всего 46!!! Не миллиарды, а 46, причём каждая из них уникальна, причём синтезировать полностью новую нереально долго и затратно, в общем разрушать всю ДНК и синтезировать новую вообще не выгодно, тем более, белок мы делаем по гену, а ДНК только по ДНК – сложная задачка. Вот именно поэтому для ДНК созданы сложные разнообразные механизмы локальной репарации, т.е. не вся молекула переделывается, а только её повреждённые участки. Ни для каких других молекул таких систем репарации нет. Почему важно репарировать ДНК? ДНК хранит, передаёт и реализует наследственную информацию и отвечает вообще за всё в клетке, повреждённая ДНК – неправильный белок – невыполнение функции белка – патология любой тяжести.
А теперь к делу. Прежде, чем говорить о репарации (исправлении повреждений), нужно поговорить о том, какого рода вообще бывают повреждения, ведь для каждого типа повреждения нужен свой тип репарации. Повреждения бывают спонтанными (ошибки репликации, депуринизация, дезаминирование) и индуцированными (образование димеров азотистых оснований, химическое модифицирование азотистых оснований).
Ошибки транскрипции. Действительно, ДНК-полимеразы порою вставляют не те нуклеотиды. Полимеразы дельта и эпсилонт способны обнаруживать свою ошибку, делать шаг назад и исправлять её (умнее ферментов в жизни не видел), а вот альфа-ДНК-полимераза на такое неспособна, да и сигма с эпсилонт не прям всегда замечают ошибки – в общем нужна система, замечающая и исправляющая эти ошибки. При таких ошибках образуется пара некомплиментарных оснований, они нарушают структуру двойной спирали, это замечает белок mutS, он садится на эту пару. На протяжение всей ДНК периодически встречается последовательность ЦТАГ, причём у материнской цепи аденин метилированный, на такую ближайшую к mutS неметилированную (дочернюю) последовательность
110