2 курс / Биохимия / Биоорганическая_химия_Кнорре_Д_Г_,_Годовикова_Т_С_,_Мызина_С_Д_

глощения для нуклеозидов и нуклеотидов при pH 7 и молярные коэффициен­ ты экстинкции при этих длинах волн.

Таблица 3 Спектральные характеристики основных нуклеозидов и нуклеотидов

при pH 7

Приведенные величины молярных коэффициентов экстинкции (е) нельзя непосредственно использовать для получения этих величин для олиго- и по­ линуклеотидов. Даже в однонитевых полинуклеотидах, т. е. в отсутствие вто­ ричной структуры, гетероциклы в соседних звеньях цепи достаточно сильно влияют на величины экстинкций. Так, коэффициент экстинкции для моно­ нуклеотида рА равен 15 400, а для АрА в расчете на один остаток А - 13 700 М^см'1. Более правильно для таких оценок использовать величины в для динуклеотидов, приведенные для 260 нм в табл. 4.

Таблица 4 Величины экстинкции для четырех основных мононуклеотидов и всевозможных

динуклеотидов

Одним из центральных вопросов биоорганической химии нуклеиновых кислот, а в равной степени и других биополимеров, является изучение и при­ менение их химических превращений. Они широко используются при уста­ новлении первичной структуры, в первую очередь, для селективного расщеп­ ления огромных молекул на фрагменты, доступные современным методам секвенирования. Реакционная способность нуклеотидных остатков молекул нуклеиновых кислот существенно зависит от их расположения в пространст­ венной структуре нуклеиновых кислот и особенно в составе нуклеопротеидов. Поэтому исследование реакций определенных остатков этих структур дает информацию об их пространственной организации. В этом случае хими­ ческие реакции становятся инструментом исследования. Химические реакции широко используются для получения различных производных нуклеиновых кислот (дериватизации), например, несущих радиоактивные или флуорес­ центные метки, которые находят многочисленное применение при изучении живых организмов. Наконец, химические методы лежат в основе искусствен­ ного синтеза нуклеиновых кислот, в том числе генов, поэтому в последую­ щих параграфах (§ 2.2-2Л) рассматриваются химические превращения нук­ леиновых кислот и их компонентов.

§2.2. Реакции по гетероциклическим основаниям

2.2.1.Реакционные центры в гетероциклических основаниях

Гетероциклические основания, входящие в состав нуклеиновых кислот и их фрагментов, содержат несколько различных реакционных центров как на атомах углерода, так и на атомах азота самих циклов и в составе экзоциклических аминогрупп. Некоторые реакции проходят по нуклеофильным ато­ мам кислорода карбонильных групп. В табл. 5 приведены основные реакци­ онные центры гетероциклических оснований в нуклеиновых кислотах и их компонентах. В этих соединениях гетероциклы связаны атомами азота N1 пиримидиновых или N9 пуриновых оснований с атомами С-Г остатков рибозы или дезоксирибозы, причем R означает остаток рибозы в случае нуклеозидов, остаток рибозилфосфата в случае нуклеотидов и олигоили полинуклео­ тид в случае олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот.

Для гетероциклических оснований характерны реакции присоединения по двойным связям. Наиболее широко используются реакции по связи С5=С6 пиримидиновых оснований. В табл. 5 эти два атома С обведены овалами. Центрами, для которых характерно взаимодействие с электрофильными реа­ гентами, являются атомы С5 пиримидиновых и С8 пуриновых оснований. В этой таблице данные атомы обведены квадратами. По атому С6 пиримиди­ новых оснований присоединяются нуклеофилы. Атака нуклеофильными реа­ гентами может также происходить по атомам С4 урацила, тимина и таутомерной формы цитозина. В табл. 5 эти атомы обведены треугольниками.

В состав всех гетероциклов нуклеиновых кислот и их компонентов входят атомы азота. Три из четырех основных гетероциклов содержат атомы -N=. У них неподеленная пара электронов находится на одной из .^-гибридных орбиталей, причем эта орбиталь лежит в плоскости гетероцикла. Такими ато­ мами являются N3 цитозина, атомы N1, N3 и N7 аденина и атомы N3 и N7 гуанина. Их часто называют атомами пиридинового типа. В таблице они об­ ведены кружками. Кроме того, атом N входит в некоторые гетероциклы (урацил, тимин, гуанин, гипоксантин) в виде фрагмента NH-CO, у которого непо­ деленная пара электронов атома N сопряжена с л'-связью С=0 группы. Эти группировки в табл. 5 обведены прерывистыми квадратами. Атомы азота также входят в состав экзоциклических аминогрупп, которые присутствуют

можно привести несколько групп превращений по гетероциклам. Описываемые в этом разделе превращения могут в соответствующих ус­

ловиях происходить как с мономерами, так и в составе нуклеиновых кислот. Однако в последнем случае превращения будут затруднены по чисто про­ странственным причинам и особенно в результате участия гетероциклов в специфических взаимодействиях, таких как образование между ними водо­ родных связей, играющих важную роль в формировании пространственной структуры нуклеиновых кислот (§ 4.1) и их связей с белками при образовании нуклеопротеидов (§ 12.4).

2.2.2. Таутомерные превращения и кислотно-основные свойства нуклео­ зидов и нуклеотидов

Гетероциклические основания могут претерпевать таутомерные превра­ щения. Ниже приведены возможные таутомерные формы четырех основных гетероциклов. Эти формы отличаются по своим спектральным характеристи­ кам, реакционным центрам и способности к нековалентным взаимодействиям

(рис. 8).

X = Н урацил

X = СН3 тимин

NH

iHN

(кетимин)

( енамин)

HN

У >

I

R

Рис. 8. Таутомерные формы основных нуклеозидов

Некоторые реакционные центры гетероциклических оснований могут протонироваться, приобретая положительный заряд, а NH-группы, сопря­ женные с С=0 группами в урациле, тимине и гуанине, могут ионизоваться. На рис. 9 представлены схемы образования протонированных и ионизован­ ных форм оснований в составе нуклеозидов.

р/С = 9,2 хх>

NHo NHo

Рис. 9. Кислотно-основные превращения оснований в составе нуклеиновых ки­ слот и их компонентов

Полные данные о значениях р/Са для нуклеозидов и нуклеотидов пред­ ставлены в табл. 6 .

ния в нуклеиновые кислоты радиоактивных изотопов иода. Атом F в пятое положение уридина можно ввести с помощью трифторгипофторита.

Как в составе нуклеозида, так и более крупных фрагментов нуклеиновой кислоты атом брома способен к различным реакциям замещения, что позво­ ляет вводить в нуклеиновые кислоты различные, например, флуоресцирую­ щие, группы.

Галогенирование пиримидиновых оснований в составе нуклеозидов су­ щественно облегчается в присутствии аммоний-церий нитрата (гексанитратоцерат (IV) аммония). Выходы иод-, бром- и хлорпроизводных при этом превышают 90 %. Однако атомы фтора таким способом не вводятся.

Легко проходит в водном растворе меркурирование атома С5 ацетатом ртути. Эта реакция позволяет вводить атомы ртути непосредственно в нук­ леиновые кислоты. Меркурирование, как и введение брома, открывает дорогу к получению многочисленных производных. Например, в присутствии в ка­ честве катализатора K2PdCl4 в меркурированные производные можно ввести непредельный углеводородный остаток. Поскольку в итоге образуется нульвалентный палладий, то процесс может происходить в каталитическом режи­ ме, если в системе присутствует окислитель (например, СиСЬ), способный регенерировать двухвалентный палладий. Условия реакции настолько мяг­ кие, что позволяют проводить процесс с уридин-5 ’-трифосфатом, т. е. с со­ хранением достаточно лабильного трифосфатного фрагмента.

P-P-P-dRib

Этот нуклеозидтрифосфат, как и ряд других, содержащих модифициро­ ванный в пятом положении остаток пиримидинового основания, сохраняет субстратные свойства по отношению к полимеразам нуклеиновых кислот, что позволяет вводить модифицированные остатки в олигонуклеотиды и нуклеи­ новые кислоты.

48_______ Глава 2. Биоорганическая химия нуклеотидов и нуклеиновых кислот

2.2.4. Присоединение нуклеофильных реагентов по атомам Сб и С4 пири­ мидиновых оснований

Избыточный положительный заряд на атоме С6 способствует присоеди­ нению по этому атому нуклеофильных реагентов, таких как бисульфит, гидроксиламин и его алкильные производные. Присоединение бисульфита про­ исходит в слабокислой и нейтральной среде. В щелочной среде продукт неус­ тойчив и регенерирует с отщеплением сульфит-аниона.

Из реакций с нуклеофилами наибольшее применение нашла реакция с гидразином, которая приводит к отщеплению от нуклеиновых кислот пири­ мидиновых гетероциклов. Первая стадия этой реакции представляет собой нуклеофильное присоединение гидразина по С6 и сопровождается внутримо­ лекулярной атакой ЫН2-группы гидразидного радикала на атом С4, завер­ шающейся выщеплением пиразолинона-5 (в случае урацила) или 1-метил- пиразолинона-5 (в случае тимина) и превращением уридина или тимидина в l-P-D-рибозил- или в l-P-D-дезоксирибозилмочевину.

Аналогичная реакция проходит и по остатку цитозина, который, скорее всего, реагирует в форме кетимина с отщеплением 5-аминопиразола. В обоих случаях l-P-D-рибозил- или l-P-D-дезоксирибозилмочевина реагируют с избытком гидразина с выделением мочевины и образованием соответст­ вующего гидразида (рис. 10).