2 курс / Биохимия / Биоорганическая_химия_Кнорре_Д_Г_,_Годовикова_Т_С_,_Мызина_С_Д_

30 Глава 1. Нуклеиновые кислоты. Строение и главные функции

других РНК в связи с тем, что кодирующие их гены имеют мозаичную струк­ туру, т. е. соответствующие последовательности дезоксирибонуклеотидов не являются непрерывными. Они могут содержать некоторые вставочные по­ следовательности, получившие название интронов. Кодирующие последова­ тельности, разделенные интронами, в этом случае называют экзонами. При транскрипции получаются РНК-предшественники (пре-РНК), содержащие и нужные в конечной (зрелой) молекуле РНК фрагменты, и лишние, которые должны быть удалены (вырезаны) из пре-РНК. Каждое вырезание должно сопровождаться воссоединением концов последовательных экзонов, между которыми находился интрон. Этот процесс получил название сплайсинг. При образовании мРНК сплайсинг происходит после образования кэпа и полиаденилирования (см. ниже).

При формировании подготовленной к трансляции мРНК с первичным транскриптом происходит несколько ферментативных превращений (рис. 5). Первым процессом является отщепление от находящегося на 5’-конце транс­ крипта трифосфатной группы одного остатка фосфорной кислоты, т. е. на 5’-конце образуется дифосфат (2). На следующей стадии остаток GMP от GTP (3) переносится на концевой дифосфат транскрипта с образованием ме­ жду ними остатка трифосфата, связанного по двум концам с 5’-ОН-группой гуанозина и концевым остатком транскрипта (4). Далее происходит метилиро­ вание N7 атома гуанина и метилирование одного или нескольких ОН-групп, примыкающих к 5’-концу транскрипта. Образование этой конструкции (кэпа, 5)

называют кэпированием.

После образования кэпа обычно происходит метилирование одной или нескольких 2’-ОН групп нуклеотидных остатков, примыкающих к кэпу.

Для окончательного формирования мРНК требуется еще одна модифика­ ция - присоединение к 3’-концевой ОН-группе транскрипта нескольких де­ сятков остатков (от 50 до 200) аденозин-5’-монофосфата (полиаденилированиё). Полиаденилирование, равно как и наличие кэпа, защищает транскрипт от действия внутриклеточных нуклеаз.

Вторая большая группа посттранскрипционных процессов представлена модификацией оснований, а в некоторых случаях также метилированием 2’-ОН группы рибозы, происходящей в основном в составе тРНК. Модифи­ цированные гетероциклы, представленные в каждой модифицированной РНК единичными звеньями или небольшим числом, называют минорными основа­ ниями. В табл. 2 приведены нуклеозиды, содержащие некоторые наиболее распространенные минорные основания. К их числу относят дигидроурацил, в котором гидрирована связь С5=С6 в урациле; тимин, характерный для ДНК, но изредка присутствующий вместо урацила также и в составе РНК; 4-тиоурацил, придающий чувствительность тРНК к УФ-облучению. Своеоб­ разную структуру имеет широко представленный в различных тРНК нуклеозид псевдоуридин, в котором урацил связан с рибозой не C-N, а С-С гликозидной связью с атомом Сб. Присутствие инозина в антикодоне тРНК влияет на специфичность взаимодействия тРНК и мРНК. Очень распространенной

Таблица 2

Некоторые наиболеераспространенные модифицированные

нуклеозиды в составе тРНК

R

*R - остаток рибозы.

Внастоящее время выявлено более 80 различных минорных оснований

всоставе тРНК из разных живых организмов. Все они естественно являются продуктами постгранскрипционной модификации продуктов транскрипции. Их функциональное значение выявлено лишь в отдельных случаях. Полную информацию о минорах в составе тРНК, их структурах и биологических ис­ точниках можно найти на сайте http//ma-mdb.cas.albany.edu/RNAmods.

Единственная функционально значимая модификация у эукариот ДНК (пострепликационная модификация) - это метилирование остатков цитозина

по атому С5, которое происходит по самокомплементарным фрагментам CpG. Донором СНз-группы служит S-аденозилметионин. В ДНК генома встречаются участки, богатые фрагментами CpG (CpG-островки). Транскрипционно активны участки ДНК, у которых CpG не метилированы. Участ­ ки, богатые метилированными CpG, как правило, мало или вообще неактив­ ны. У бактерий пострепликативное метилирование может происходить также по экзоциклическим аминогруппам аденина (N6) и цитозина (N4). При реп­ ликации метилированные фрагменты расходятся по двум дочерним нитям, и образуется дуплексный фрагмент, в котором один из цитозинов метилиро­ ван, а второй нет. Специфичная к таким фрагментам метилаза метилирует второй цитозин, как показано на схеме.

сн3

Благодаря специфичности этой метилазы после репликации восстанавли­ ваются метилированные по обоим цитозинам CpG-фрагменты, но не проис­ ходит метилирование каких-либо дополнительных оснований, т. е. при раз­ множении сохраняется распределение метилированных цитозинов по ДНК (подобные распределения часто называют паттернами (от англ. pattern - вы­ кройка, узор).

34Глава 1. Нуклеиновые кислоты. Строение и главные функции

§1.9. Вирусы и инфекционные нуклеиновые кислоты

Помимо участия в описанных и ряде других процессов, связанных с функ­ ционированием клеток, нуклеиновые кислоты являются компонентами мно­ гочисленных вирусов. Вирусы представляют собой инфекционные частицы, содержащие нуклеиновую кислоту и некоторый набор белков. Таким обра­ зом, вирусы являются нуклеопротеидами. Попадая в определенные клетки хозяина, они размножаются, используя весь необходимый для этого биохи­ мический аппарат клетки. Вирусы чрезвычайно многообразны по принципам своего строения и механизму размножения. При этом носителем информации в зависимости от природы вируса могут быть как ДНК, так и РНК, причем существуют вирусы, содержащие однонитевую ДНК, а вирусные РНК вооб­ ще в большинстве случаев являются однонитевыми. Однако для их размно­ жения, которое может происходить только по принципу комплементарности, необходимо промежуточное образование комплементарной нуклеиновой ки­ слоты, программирующей синтез нуклеиновых кислот для новых вирусных частиц. В этом случае вирусную нуклеиновую кислоту квалифицируют как «плюс», а комплементарную ей промежуточную - как «минус» НК.

Кроме того, в состав зрелых вирусных частиц входят и белки, прежде все­ го белки оболочки вируса и белки-ферменты, необходимые для репликации вирусной нуклеиновой кислоты. Попадая в клетку, вирусы вносят в нее но­ вую информацию и переключают значительную часть внутриклеточного ме­ таболизма на воспроизводство новых молекул вирусной нуклеиновой кисло­ ты и на биосинтез белков, необходимых для формирования новых вирусных частиц (структурные белки) и промежуточных стадий этих процессов (не­ структурные белки). Например, в вирусе клещевого энцефалита носителем генетической информации является однонитевая вирусная РНК. При попада­ нии в инфицированную клетку эта РНК, работая первоначально как мРНК, программирует синтез неструктурного белка NS5, который далее катализиру­ ет синтез большого числа РНК-копий, комплементарных РНК вируса («ми­ нус-РНК»). Эта же РНК программирует синтез еще одного неструктурного белка NS3, который, используя информацию, содержащуюся в «минус-РНК», катализирует биосинтез большого числа молекул РНК, комплементарных «минус-РНК», т. е. идентичных исходной РНК («плюс-РНК»). Вместе с син­ тезируемыми параллельно структурными белками вируса они формируют внутри зараженной клетки большое число новых вирусных частиц, разру­ шающих в итоге клетку и способствующих распространению инфекции по организму.

Большое внимание исследователей привлекает, в частности, изучение ви­ руса иммунодефицита человека ВИЧ-1, который является носителем неизле­ чимой на данный момент болезни СПИД (синдром приобретенного иммуно­ дефицита человека). Этот вирус относится к группе ретровирусов. В состав вирусной частицы в качестве носителя информации входит вирусная РНК. Кроме того, помимо белков, формирующих вирусную частицу, в нее входит

молекула фермента обратной транскриптазы. Это фермент катализирует на первой стадии инфекции синтез молекул ДНК - комплементарных копий ви­ русной РНК (кДНК, применительно к вирусам их обычно называют «минус» ДНК). После этого образовавшиеся «минус» ДНК кодируют синтез (при по­ мощи того же фермента) комплементарных ей «плюс» ДНК, в результате че­ го образуются двунитевые ДНК, содержащие последовательности, воспроиз­ водящие последовательность нуклеотидов вирусной РНК, но построенные из дезоксирибонуклеотидов. С помощью специального, кодируемого вирусной РНК белка интегразы двунитевые ДНК встраиваются в геном человека и да­ лее, используя аппарат транскрипции и трансляции клетки, воспроизводят большое число молекул вирусной РНК и структурных белков вируса, созда­ вая условия для формирования в зараженной клетке большого числа новых вирусных частиц.

Значительное число вирусов размножаются в бактериях. В этом случае их называют бактериофагами, или просто фагами. Среди них наиболее деталь­ но изучаются и используются фаги Т4 и Т7. У самого большого из фагов этой группы, Т4, содержащего более сотни генов, запрограммирован синтез ряда ферментов, значение которых для жизнедеятельности самого фага не вполне понятно. Некоторые его ферменты нашли широкое применение в качестве инструмента биохимических исследований, например, программируемый ДНК фага Т4 фермент полинуклеотидкиназа, который катализирует присое­ динение фосфата к 5’-концу полинуклеотидов. Донором фосфата в этом слу­ чае служит у-фосфат молекулы АТР. Если последняя содержит высокомече­ ный у-фосфат, то тем самым появляется возможность ввести радиоактивную метку в 5’-конец полинуклеотида, что широко используется при установле­ нии первичной структуры и химической модификации нуклеиновых кислот. Бактериофаг Т7 содержит программу для синтеза специальной РНКполимеразы, которая обладает высокой эффективностью в синтезе РНК, при­ чем при наличии в составе ДНК, содержащей интересующий исследователя ген, позволяет получать на каждую транскрибируемую нить такой ДНК мно­ гие сотни РНК-транскриптов. В то же время среди вирусов встречаются и та­ кие, у которых наследственная программа представлена однонитевой ДНК.

В природе существуют также инфекционные частицы, состоящие только из однонитевых молекул РНК - вироиды и вирусоиды. Первые обладают спо­ собностью размножаться внутри клетки, т. е. инфекционны сами по себе, вто­ рые размножаются лишь в присутствии специальных вирусов-помощников. В обоих случаях сами инфекционные частицы представляют собой «плюс» РНК, а комплементарные им промежуточные, необходимые для их реплика­ ции, - «минус» РНК.

Глава 2. Биоорганическая химия нуклеотидов и нуклеиновых кислот

§2.1. Нуклеотиды

2.1.1.Негенетические нуклеозид-5’-трифосфаты. Нуклеозидциклофос-

фаты

В § 1.1 введено понятие о нуклеотидах как нуклеозид-5 ’-фосфатах, яв­ ляющихся структурными единицами нуклеиновых кислот. Было также сказа­ но, что при биосинтезе нуклеиновых кислот мономерами являются не моно­ фосфаты нуклеозидов, а нуклеозид-5’-трифосфаты, у которых с 5’-ОН груп­ пой пентозы связано три остатка фосфорной кислоты.

Помимо участия в качестве мономеров, в биосинтезе нуклеиновых кислот NTP выполняют другие важные биохимические функции. Так, UTP и GTP являются участниками биосинтеза олиго- и полисахаридов, а СТР участвует в биосинтезе фосфолипидов.

Важнейшим участником огромного числа биохимических процессов яв­ ляется АТР - основной аккумулятор энергии в живой природе. Подавляющее число биохимических процессов, идущих с повышением свободной энергии Гиббса AG, протекает сопряженно с гидролизом одной из пирофосфатных связей

в АТР. Гидролиз пирофосфатной связи между а- и (3-фосфатами происходит

сAG0 - -31,8 кДж/моль, а между Р- и у-фосфатами с AG0 - -31,0 кДж/моль. Кроме того, АТР является донором фосфата в многочисленных биохимиче­ ских реакциях фосфорилирования. Например, превращение глюкозы в глю-

козо-6-фосфат имеет AG°’= -13,8 кДж/моль, т. е. реакция фосфорилирования глюкозы с помощью АТР характеризуется значением AG0’ = -18,0 кДж/моль. Систематически эти процессы рассматриваются в курсах биологической химии.

Остаток фосфорной кислоты может быть связан одновременно с двумя ОН-группами. Такие нуклеотиды называют нуклеозидциклофосфатами. На­ пример, при действии ряда химических реагентов, способствующих образо­ ванию фосфоэфирных связей, на нуклеозид-3’-фосфаты легко получается связь с соседней 2’-ОН группой с образованием нуклеозид-2’,3’- циклофосфатов. В этом случае используют обозначение циклофосфатного фрагмента в виде символа >. Например, уридин-2’,3’-циклофосфат обозна­ чают как U > р.

О

нуклеозид-2',3'-циклофосфат U>p

Гуанозин-3’,5 ’-циклофосфат и аденозин-3\5 ’-циклофосфат участвуют в регуляции большого числа биохимических процессов (§ 17.1).

2.1.2. Конформация полинуклеотидной цепи. Взаимная ориентация пентозного гетероцикла в нуклеиновых кислотах

Биологическое функционирование белков и нуклеиновых кислот нераз­ рывно связано с их пространственной структурой. Геометрия любой молеку­ лы определяется тремя группами геометрических характеристик ее химиче­ ских связей - длинами всех ковалентных связей, углами между связями, об­ разуемыми каждым из атомов молекулы, и торсионными углами между свя­ зями, примыкающими к соседним атомам. Первые две группы характеристик для атомов лежат в достаточно узких пределах и сравнительно мало влияют на геометрию молекулы в целом. Поэтому геометрия макромолекулы в ос­ новном определяется торсионными углами между атомами остова молекулы. Эти углы определяют взаимное расположение в пространстве четырех сосед­ них атомов А, В, С и D. Схема определения понятия торсионного угла приве­ дена в приложении.

При описании истинной конформации нуклеиновых кислот и их компо­ нентов в свободном виде и в составе нуклеиновых кислот возникает три главных вопроса. Первый - это конформация рибозофосфатного остова (кон­ формация полинуклеотидной цепи), состоящего из периодически повторяю­ щихся атомов Р, 0-5’, С-5’, С-4’, С-3’, 0-3’ Она описывается шестью торси­ онными углами - а, р, у, 8, е, г|, характеризующими повороты вокруг шести

38 Глава 2. Биоорганическая химия нуклеотидов и нуклеиновых кислот

повторяющихся связей: Р - 0-5’, 0-5’ - С-5’, С-5’ - С-4’, С-4’ - С-3’, С-3’ - 0-3’ и 0-3’ - Р (рис. 6).

Р

I

Рис. 6. Торсионные углы в полинуклеотидной цепи

Именно эти углы определяют общий ход полинуклеотидной цепи. Сама по себе полинуклеотидная цепь не имеет какой-либо резко предпочтительной конформации, и последняя в основном определяется взаимодействиями меж­ ду гетероциклическими основаниями. Эти взаимодействия и вытекающие последствия для пространственной структуры нуклеиновых кислот рассмат­ риваются в гл. 5.

Два других вопроса - это конформация нуклеотидов и нуклеотидных звеньев в составе нуклеиновых кислот. Это, во-первых, конформация угле­ водного фрагмента. Он является общим для нуклеотидов и углеводов и по­ этому рассматривается в гл. 13, посвященной биоорганической химии угле­ водов. Во-вторых, это взаимная ориентация углеводного звена и гетероцик­ лического основания.

Взаимная ориентация фуранозного цикла и гетероциклического основа­ ния определяется торсионным углом, описывающим поворот гетероцикла вокруг гликозидной связи (конформация по гликозидной связи).

Этот угол, обозначаемый х> определяется как угол для системы атомов 0-4’ - С-1 ’ - N1 - С2 у пиримидиновых и 0-4’ - С-1 ’ - N9 - С4 у пуриновых нуклеотидов. Для качественного рассмотрения можно в грубом приближении представить себе, что средняя плоскость фуранозного цикла и плоскость ге­ тероцикла взаимно перпендикулярны. Торсионный угол %определяет, какая часть гетероцикла оказывается над плоскостью фуранозного кольца, а какая соответственно повернута в сторону от кольца. Две стороны гетероциклов, как в случае пуринов, так и в случае пиримидинов, неэквивалентны. Наибо­ лее близкими к плоскости, характеризующей расположение фуранозного цикла в случае пиримидиновых гетероциклов тимина, урацила и цитозина, являются группа С6 -Н6 . Группа С2-02 существенно более объемная и к тому же полярная. В случае пуриновых гетероциклов - аденина и гуанина - бли­

жайшими к той же плоскости оказываются группа С8-Н8 и существенно бо­ лее объемистый фрагмент C4-N3-C2 (рис. 7).

HVv

Рис. 7. Ориентация гетероцикла относительно фуранозного цикла: а - анти- конформация; б - син-конформация

Конформации, при которых более объемистый фрагмент повернут в на­ правлении от фуранозного кольца, называют анти-конформациями. В боль­ шинстве случаев в составе нуклеиновых кислот анти-конформации являются предпочтительными. В противоположной ситуации, когда над фуранозным кольцом располагается фрагмент С2-02 пиримидина или шестичленный цикл пуриновой системы, конформации называются син-конформациями.

Предпочтительность антии-конформации не является абсолютной. В сле­ дующей главе будут описаны случаи, когда в нуклеиновых кислотах гуанозин находится в син-конформации. Кроме того, последняя оказывается пред­ почтительной у модифицированных оснований, если в положение 6 пирими­ дина или положение 8 пурина вводятся объёмистые заместители, например, метальная группа или атом брома.

2.1.3. Спектральные характеристики нуклеозидов и нуклеотидов

Гетероциклические основания, а также нуклеиновые кислоты и их компо­ ненты обладают характерными спектрами поглощения в ближней ультрафио­ летовой области спектра. Каждый нуклеозид и нуклеотид в зависимости от входящего в его структуру основания имеет характерный спектр в области 220-280 нм. В табл. 3 приведены длины волн в максимуме и минимуме по­