4 курс / Акушерство и гинекология / Роль_протеина_ALK5_в_профиле_ранних_репродуктивных
.pdf51
дефекты бластоцисты, имплантации, дезорганизацию клеток трофобласта, меньшее количество клеток естественных киллеров матки (uNK) и нарушение ремоделирования спиральной артерии.
TGF-β действует на децидуальные клетки через ALK5, вызывая экспрессию других факторов роста и цитокинов, которые являются ключевыми регуляторами пролиферации просвета эпителия, развития трофобласта и созревания uNK во время беременности. Авторы отмечают снижение инвазивности трофобласта, связанное с повышенным уровнем его апоптотической гибели. Исследователи полагают, что индукция апоптоза трофобласта может осуществляться макрофагами двумя путями: секрецией TNFα и его действием на ALK5, экспрессируемые трофобластом, а также созданием дефицита триптофана под действием экспрессируемой макрофагами индоламин-2,3-диоксигеназы [191].
Ангиогенез соответствует образованию новых кровеносных сосудов из ранее существовавшей сосудистой сети путем прорастания, расщепления и ремоделирования примитивной сосудистой сети. И васкулогенез, и ангиогенез участвуют в развитии функциональной сосудистой системы у эмбриона, но также вносят свой вклад вформирование постнатальных кровеносных сосудов. У взрослых неоваскулярный ответ возникает в различных физиологических и патологических условиях, включая заживление ран, восстановление после инфаркта миокарда, заболевания, связанные с воспалением, рост солидной опухоли и метастазирование опухоли. Васкулогенез и ангиогенез строго регулируются факторами роста. Эти факторы включают фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста фибробластов-2 (FGF-2), фактор роста тромбоцитов и трансформирующий фактор роста-β1 (TGFβ1) [211].
Во время эмбрионального формирования человеческого организма эмбрион зависит от кровоснабжения для развития и роста. Поскольку кровь поступает через кровеносные сосуды, образование кровеносных сосудов является важным процессом как во время эмбрионального развития человека, так и на постнатальных этапах жизни. Эндотелиальные клетки выстилают
52
внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, и они необходимы для образования кровеносных сосудов, поскольку они пролиферируют, мигрируют и вторгаются во внеклеточный матрикс (ВКМ), формируя сосудистые структуры по всему телу человека. В качестве основного подтипа рецепторов типа I TGF-β, ALK5 играет важную роль в формировании сосудов во время эмбрионального развития.
Специфический для эндотелиальных клеток (ЭК) ALK1 увеличивает пролиферацию и миграцию ЭК, тогда как повсеместно экспрессируемый ALK5 ингибирует оба этих процесса. Поскольку ALK1 требует киназной активности ALK5 для оптимальной активации, отсутствие ALK5 в ЭК приводит к дефектному фосфорилированию обоих путей Smad при стимуляции TGF-бета [220].
Чтобы понять, почему передача сигналов TGF-бета через ALK1 и ALK5 оказывает противоположное влияние на ЭК и имеет ли это место in vivo, Itoh F. et al. [143] сравнили фенотип мышей с нокаутом ALK5 (ALK5 (KI / KI)), у
которых остаток аспарагиновой кислоты 266 в петле L45 ALK5 был заменен остатком аланина, с фенотипами нокаута ALK5 (ALK5 (- / -)) и мышей дикого типа. У мышей ALK5 (KI / KI) обнаружены ангиогенные дефекты с эмбриональной летальностью на E10,5-11,5. Хотя фенотип мышей ALK5 (KI / KI) был очень похож на фенотип мышей ALK5 (- / -), иерархическая структура кровеносных сосудов, сформированных у эмбрионов ALK5 (KI / KI), была более развитой, чем у мышей ALK5 (KI / KI). Мутанты ALK5 (- / -). Таким образом, мутация петли L45 в ALK5 частично спасла самые ранние сосудистые дефектыу эмбрионовALK5 (-/ -).Это исследованиеподтверждает наши более ранние наблюдения, что для созревания сосудов in vivo требуются пути TGF-beta / ALK1 / BMP-Smad и TGF-beta / ALK5 / активин-Smad для нормального развития сосудов.
В исследовании Rossant J., посвящённом условной инактивации Alk5, было обнаружено развитие эстрогензависимой аденокарциномы эндометрия с отдаленными метастазами в легких. Однако, осложняет понимание роли Alk5
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
53
в имплантационных процессах тот факт, что морфология предимплантационного эмбриона человека не идентична с аналогичным процессом у эмбриона мыши, которая наиболее часто является экспериментальной моделью в контексте исследования данной темы. После оплодотворения оба эмбриона подвергаются митотическим клеточным делениям, уплотнению и кавитации с образованием бластоцисты, состоящей из слоя трофэктодермы (TE) и внутренней клеточной массы (ICM). Несмотря на это сходство, существует ряд существенных различий, таких как время деления, расщепления, образования бластоцисты и непосредственно имплантации [196].
54
Резюме по обзору литературы
Женщины составляют растущий сегмент пациентов, обращающихся за услугами по лечению бесплодия, такими как ВРТ. При этом частота выкидышей среди беременностей после ВРТ, как и при спонтанных зачатиях, увеличивается с возрастом. Конкретная причина субфертильности также может повлиять на частоту выкидышей: например, женщины имеющие вредные привычки, избыточный или недостаточный вес, с наличием в анамнезе инфекционных заболеваний, с некоторыми врожденными аномалиями матки, миомами и эндокринными нарушениями имеют более высокий уровень ранних репродуктивных потерь, чем те, у которых их нет.
В женском репродуктивном тракте TGFβ, Alk5 и его нижестоящие сигнальные факторы, SMAD2 и SMAD3, имеют решающее значение для структурной целостности миометрия и яйцеводов. Фактически, условная абляция TGFBR1/Alk5 в мышцах матки и стромальных компартментах матки с рецептором Amhr2-cre приводит к аномальному развитию гладких мышц, что приводит к дивертикулам яйцеводов и нарушению транспорта эмбрионов. Альтернативно, удаление TGFBR1/Alk5 из маточной мышцы, стромы и эпителия с помощью рецептора прогестерона приводит к дефектам эндометрия и плаценты, что приводит к аномальному развитию эмбриона и бесплодию. Модуляция активности рецепторов является критическим шагом для регуляции передачи сигналов TGF-β.
Было показано, что члены суперсемейства TGFβ играют роль в формировании кровеносных сосудов. В большинстве типов клеток TGFβ передает сигнал через активиноподобную киназу 5 (ALK5) рецептора TGFβ типа I, но эндотелиальные клетки экспрессируют специфический для эндотелия рецептор TGFβ типа I ALK1. Таким образом, TGFβ может передавать сигналы через рецепторы ALK1 и ALK5 в эндотелиальных клетках.
Несмотря на то, что было приложено много усилий для понимания регуляторных механизмов активности и стабильности рецептора Alk5, его значение в развитии сосудов эмбриона с целью обеспечения сохранения
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
55
беременности, многие вопросы еще не решены.
56
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Организация исследования
Исследование выполнено на базе гинекологического отделения, кафедры патологической анатомии и отделения вспомогательных репродуктивных технологий Перинатального центра Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «СанктПетербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Забор децидуальной ткани проводился амбулаторно на базе кафедры акушерства и гинекологии СПБ ГПМУ, иммуногистохимическое исследование проведено на базе кафедры патологической анатомии с курсом судебной медицины СПБ ГПМУ.
Комиссия по вопросам биоэтики при Санкт-Петербургском государственном педиатрическом медицинском университете считает, что данная работа отвечает всем этическим требованиям (протокол № 1/6 от 21 января 2019 г). В заключении указано, что работа соответствует принципам Хельсинской декларации, принятой Генеральной ассамблеей Всемирной Медицинской Ассоциации, Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине, соответствующим положениям ВОЗ, Международного совета медицинских научных обществ, Международного кодекса медицинской этики и законам РФ, полностью исключает ущемление интересов пациенток и нанесение вреда их здоровью.
В соответствии с поставленной целью и задачами исследования, научные поиски осуществлялись в несколько этапов.
На первомэтапеанализировалисьисточники научной литературыпо теме исследования. Формулировались цель, гипотеза, задачи, объект и предмет исследования, подбирались методы исследования, адекватные задачам исследования.
На втором этапе исследования проведен ретроспективный клиникостатистический анализ 120 медицинских карт беременных после ВРТ, отобранных за период с 2018 по 2020 год. Анализ материалов проводился с
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
57
помощью программы Microsoft Exel 2016, в которую вносились задокументированные данные из медицинских карт. Показатели результатов в данном исследовании были обработаны путем вычисления средней выборочной (М), оценки стандартного отклонения средней выборочной (m). Полученные данные анализировались с помощью непараметрических тестов. Для расчета статистически значимых различий между группами использовался критерий Манна-Уитни (U-критерий).
На третьем этапе исследования проведено иммуногистохимическое исследование децидуальной ткани абортивного материала при ранних репродуктивных потерях с целью выявления экспрессии ALK5. Образцы децидуальной ткани собраны в гинекологическом отделении СанктПетербургского государственного педиатрического медицинского университета с января 2018 по декабрь 2020 года, в исследовании использованы ткани 40 пациенток в возрасте 25-40 лет, с менструальным циклом 28-30 дней, с нормой хромосомного кариотипа пары. Кроме того, проводилась оценка прогностического и клинического значения экспрессии ALK5 в профиле ранних репродуктивных потерь после ВРТ.
На четвертом этапе осуществлялась обработка полученных данных и анализ результатов исследования, формулирование выводов и рекомендаций по проведенному исследованию, подготовка текста и оформление диссертационной работы.
2.2. Общая клиническая характеристика женщин, которые были включены в исследование
Проведен ретроспективный клинико-статистический анализ, в частности отбор 344 медицинских карт беременных, которые содержали данные о раннем самопроизвольном аборте из 1274 медицинских карт пациенток перинатального центра, из которых нами взято 60 женщин в возрасте от 25 до 45 лет с индуцированной беременностью после ВРТ с зарегистрированным ранним самопроизвольным абортом в гестационном сроке 6-8 недель (или
58
через 4-6 недель после переноса эмбрионов). В группу сравнения было отобрано60 медицинскихкартпациенток ввозрастеот25до45летпослеВРТ, у которых беременность протекала без каких-либо осложнений.
Среди двух групп пациенток после ВРТ были оценены этиологические факторы риска ранних репродуктивных потерь после ВРТ на основе клиникостатистического анализа. В рамках анализа оценивали социальный анамнез: возраст, вес, вид деятельности, образование, влияние вредных факторов и вредных привычек; гинекологический анамнез: перенесенные воспалительноинфекционные, экстрагенитальные заболевания и оперативные вмешательства,регулярность менструального цикла, длительность и характер менструаций; репродуктивный анамнез (аборты, выкидыши, преждевременные роды), продолжительность бесплодия, количество попыток ВРТ, тип бесплодия, протокол контролируемой гиперстимуляции яичников, метод оплодотворения, общая доза гонадотропина, уровень ХГЧ в сыворотке через 14 дней после переноса (МЕ / л).
Критерием включения в группу иммуногистохимического исследования децидуальной ткани абортивного материала при ранних репродуктивных потерях с целью выявления экспрессии ALK5 (20 пациенток центра репродуктивной медицины) являлся состоявшийся ранний самопроизвольный аборт после ВТР в гестационном сроке 6-8 недель (или через 4-6 недель после переноса эмбрионов). Пациенткам центра репродуктивной медицины после процедуры переноса эмбриона через 3-4 недели после трансплантации выполняли абдоминальное ультразвуковое исследование, подтверждающее наличие внутриматочной беременности. При отсутствии признаков прогрессирования в течение 7 суток (роста ХГЧ, сердцебиения плода при УЗИ), проводилось хирургическое прерывание (20 пациенток). После внутривенной анестезии проводилась вакуум-аспирация, полученный материал отправлялся на исследование.
Критериемвключения вгруппу контроля (20 здоровых женщин) являлось выполненное плановое хирургическое прерывание одноплодной
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
59
прогрессирующей беременности, наступившей в естественном цикле, по их желанию в гестационном сроке 6-8 недель без тенденции к угрозе прерывания беременности.
С целью получения достоверных данных при определении экспрессии ALK5 основная группа пациенток и группа сравнения подбирались с учетом их идентичности по основным показателям: возраст (25-45 лет), социальноэкономическое, семейное положение, особенности акушерскогогинекологического анамнеза, экстрагенитальная патология и др. Получали информированное согласие женщин на использование биологического материала в научных целях.
Критерием исключения из иммуногистохимического исследования являлось наличие соматических, аутоиммунных, наследственных генетических заболеваний и заболеваний эндокринной системы, многоплодная беременность, случаи выявленных врожденных аномалий, отказ женщин на использование биологического материала в научных целях.
2.3. Методы исследования
Для получения объективных результатов был применен комплексный подход с использованием ряда ранее подобранных методовисследования.
Был проведен ретроспективный клинико-статистический анализ медицинских карт пациенток перинатального центра. Аналитическое исследование оценки этиологических факторов риска ранних репродуктивных потерь после ВРТ проведено с целью выявления причин возникновения и распространенности последних. Основной задачей данного исследования является выявление причинно-следственных связей между гипотетической причиной и следствием. Сравнение частоты возникновения отдельных факторов в основной и контрольной группе позволило рассчитать показатель отношения шансов (OR), по величине которого приблизительно оценивали наличие причинно-следственной связи.
60
На этапе клинического исследования у беременных при процедуре переноса эмбриона через 3-4 недели после трансплантации выполняли абдоминальное ультразвуковое исследование, подтверждающее наличие внутриматочной беременности. Серию продольных и поперечных сканирований проводили на ультразвуковом аппарате «Philips Clear Vue» (Германия) с использованием пакетов программного обеспечения.
У всех обследованных женщин исследовалось содержание в периферической крови отдельных гормонов, в том числе ХГЧ. Гормональные исследования сыворотки крови проводились иммуноферментным методом на анализаторе Immulite 2000 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., США) с
помощью тест-системы Immulite 2000 HCG для определения хорионического гонадотропина человека. Во время исследования применяли высокочувствительные антитела.
Обследование на урогенитальную инфекцию проводилось у всех пациенток. Твердофазным иммуноферментным анализом определялись IgM и IgG в плазме крови к возбудителям Chlamydia trachomatis. Ureaplasma urealiticum и Mycoplasma hominis, Toxoplazma gondi, Rubella, Cytomegalovirus, Herpes simplex (тип 1/2).
Пациенткам проводилось хирургическое прерывание беременности методом электрической вакуум-аспирации после внутривенной анестезии. Децидуальные ткани абортивного материала препарировали и фиксировали в 10% формалине с нейтральным буфером в течение 24 часов и заливали парафином. Парафиновые срезы депарафинизировали, регидратировали и кипятили для извлечения антигена с использованием стандартных процедур. После блокирования 3% (вес / объем) BSA в течение 1 часа срезы инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C. Иммунореактивные сигналы получали с использованием набора субстратов 3,3'-диаминобензидина (DAB).
На последнем этапе проводилась оценка прогностического и клинического значения экспрессии ALK5 в профиле ранних репродуктивных
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/