4 курс / Акушерство и гинекология / ВОЗМОЖНОСТИ_ЖИДКОЙ_БИОПСИИ_В_СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ_ПРОГНОЗА_ТЕЧЕНИЯ
.pdf31
(муциноподобная молекула адгезии) [211]. Тем не менее, данные исследований с учетом этих маркеров не всегда однозначны. Так, в одной из работ высокая экспрессия CD133 в ткани РЯ наблюдалась при поздних стадиях и была ассоциирована со снижением безрецидивной и общей выживаемости [36]; в
другом исследовании корреляций между этими параметрами обнаружено не было
[83]; в третьем маркер CD133+ не имел однозначной выраженной ценности самостоятельно, однако повышал информативность исследования в комплексе с
ALDH+ [82]. Такие различия в результатах могут быть связаны как с отсутствием стандартизированной методики оценки СОК, так и с уникальной пластичностью их фенотипа.
Активация CD44 в клетках РЯ стимулирует «стволовой» сигналинг Nanog- Stat-3 [104]. Кроме того, CD44+ клетки секретируют большее количество цитокинов IL-6, IL-8, MCP-1, чем CD44- [51, 146]. Секреция воспалительных медиаторов может опосредовать взаимодействия с микроокружением и способствовать формированию стволовых и метастатических ниш. Коэкспрессия
CD44/MyD88 при распространенном РЯ связана со снижением ВБП и ОВ [51]. ALDH1(high) клетки РЯ демонстрируют выраженный клоногенный
потенциал и другие стволовые свойства, а высокая экспрессия ALDH1 в
опухолевой ткани, определенная иммуногистохимически, связана со снижением ОВ и ВБП при серозном и светлоклеточном РЯ [16, 229].
В РЯ ALDH+ клетки демонстрируют большую химиорезистентность, чем
ALDH- [195]. Это может быть связано с нарушением регуляции клеточного цикла и репарации ДНК в ALDH+ клетках [15], а также с участием ALDH в процессах детоксикации и устранении оксидативного стресса [196], развитие которого является одной из основ действия стандартной ХТ при данной патологии.
Кроме вышеназванных механизмов химиорезистентности СОК рака яичников, существует и ряд других: индукция иммунологической толерантности через взаимодействие с Т-хелперами [159]; гиперэкспрессия белков-ABC-
транспортеров, которые активно удаляют химиопрепарат из клетки
(осуществляют эффлюкс) [102]; своеобразный метаболизм с широкими
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
32
возможностями адаптации как к гипоксии, так и к оксилительному стрессу, а
также получением энергии из соседних нестволовых клеток в виде лактата [65, 209]. Вероятно, самым труднопреодолимым механизмом является способность к обратимому уходу в состояние сенесцентности [223]. Важным аспектом химиорезистентности является персистенция «спящих», или сенесцентных клеток РЯ [58]. Такие клетки реагируют на агрессивное лечение остановкой клеточного цикла в фазе G1 либо G2/M [206], становятся неидентифицируемы клинически и недоступны действию цитостатиков. При наступлении благоприятных окружающих условий они способны возвращаться к прохождению клеточного цикла, пролиферировать и давать начало рецидиву болезни. Возвращаясь к клеточному циклу после «спячки», СОК становится еще более туморогенной и имеет высокоактивный Wnt-сигналинг [187].
Возрастание числа СОК РЯ происходит при воздействии цисплатином [47];
возможно, данный эффект опосредуется сигнальным путем NF-κB-TNFα-PIK3CA [217]. Согласуются с этими данными и результаты исследования асцитической жидкости при РЯ: клетки асцита химиорезистентных пациенток обладают повышенной экспрессией мРНК генов, характерных для СОК, в сравнении с клетками асцита пациенток до лечения [119].
Таким образом, изучение циркулирующих стволовых опухолевых клеток при раке яичников представляет значительный интерес как в плане понимания фундаментальных основ канцерогенеза, так и в рамках поиска клинических биомаркеров.
1.5. Длинные некодирующие РНК в прогрессировании рака яичников
Большую роль в инициации ЭМП и стволовых свойств отводят эпигенетическим факторам, которые изменяют доступность различных генов для транскрипции либо мРНК для трансляции, не меняя структуры генома.
Обратимость эпигенетической регуляции логично вписывается в концепцию СОК как уникально пластичных клеток. Одним из механизмов такой регуляции являются длинные некодирующие РНК (lncRNA) – молекулы РНК длиной от 200
33
до сотен тысяч нуклеотидов, не кодирующие белок. Изначально они считались
«транскрипционным мусором», но позднее оказалось, что lncRNA регулируют самые разнообразные, в том числе жизненно важные процессы в клетке.
Функциональное назначение конкретной lncRNA определяется ее нуклеотидной последовательностью, а также вторичной и третичной структурами. Сложность структуры позволяет lncRNA взаимодействовать с белками, белковыми комплексами, нуклеиновыми кислотами. В свою очередь, эти взаимодействия приводят к конформационным изменениям, позволяющим связываться с новыми участниками процессов экспрессии генов и трансляции [2]. Таким образом, один из способов функционирования lncRNA - служить «площадкой» для взаимодействия других регуляторов жизнедеятельности клетки. Кроме того, lncRNA непосредственно регулируют транскрипцию; связываются с белками,
ремоделирующими хроматин, и направляют их в локусы-мишени генома;
участвуют в процессах альтернативного сплайсинга и деградации мРНК;
взаимодействуют с рибосомами [139]; служат предшественниками микроРНК
[133]. LncRNA, способные секвестрировать в себе микроРНК и изолировать их,
получили название «конкурирующих эндогенных РНК». При этом множество lncRNA способны инактивировать одну и ту же микроРНК, и множество микроРНК могут инактивироваться одной lncRNA, что формирует крупную сеть взаимодействий.
Широкий спектр генов и белков, подверженных влиянию lncRNA,
определяет участие последних в развитии разнообразных патологических состояний, в том числе в канцерогенезе. В исследованиях продемонстрировано,
что lncRNA могут выполнять как онкогенную, так и супрессорную функцию, и
регулировать все ключевые признаки рака («hallmarks of cancer») [96]. LncRNA
действуют не только в самой опухолевой клетке, но и в опухолевом микроокружении [72]. Например, в опухолевых тканях плоскоклеточного рака головы и шеи наблюдали взаимосвязь между паттерном экспрессии lncRNAи
иммунологическим «портретом» (выраженность инфильтрации CD8+ Т-клетками,
экспрессией биомаркеровиммуносупрессии) [19]. Иммуносупрессия характерна
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
34
как для плоскоклеточного рака головы и шеи, так и для эпителиального РЯ; до настоящего времени применение иммуностимулирующих препаратов, в частности ингибиторов PD-L1, при РЯ не привело к удовлетворительным результатам в лечении. Это может свидетельствовать о наличии неких неизученных особенностей иммунной регуляции в микроокружении опухолей яичников.
Некоторые авторы также предполагают, что lncRNA способны функционировать подобно гормонам, поступая в составе экзосом с током крови в отдаленные от места их синтеза ткани и вызывая дистантные эффекты [165].
В связи с возрастающим интересом к жидкой биопсии, все больше работ посвящается обнаружению lncRNA в биологических жидкостях организма и оценке их диагностического, прогностического и предиктивного биомаркерного потенциала [202]. В крови они существуют в составе экзосом, апоптотических телец, в связи с белками или липопротеинами, либо циркулируют свободно [130].
Стабильность молекул lncRNA в плазме достаточно высока, а экспрессия многих из них тканеспецифична [181].
Исследованию lncRNA-профиля РЯ посвящено большое число работ [67]. В
мета-анализе 2018г. было выявлено, что больные РЯ с нарушением lncRNA-
профиля опухоли имеют более низкую ОВ и ВБП, и наиболее показательными в этом отношении были 11 lncRNA, включая HOTAIR, TC010441, AB073614, ANRIL, MALAT1, NEAT1, CCAT2, UCA1, HOXA11as, SPRY4-IT1, и ZFAS1,
значимо гиперэкспрессируемые в опухолевых образцах в сравнении с нормальными тканями [17]. AkramiR. etal. (2013) обнаружили 455 lncRNA,
экспрессия которых значимо снижалась либо повышалась специфично для определенного генетического подтипа РЯ согласно классификации
TheCancerGenomeAtlas. Существует гипотеза о том, что эпигенетические факторы, и, в частности, lncRNA, определяют судьбу стволовых клеток,
содержащихся в поверхностном эпителии яичника и способным давать начало эпителиальному раку [145]. При этом паттерн экспрессии lncRNA при РЯ меняется не только в самих опухолевых клетках, но и в опухоль-ассоциированных фибробластах в сравнении с нормальными фибробластами [89].
35
Установлено, что определенные варианты гена HOTAIR ассоциированы с предрасположенностью к развитию РЯ [91]. На сегодняшний день обнаружена корреляция между высокой экспрессией HOTAIR в ткани РЯ и неблагоприятными клиническими характеристиками: распространенной стадией болезни, низкой дифференцировкой опухоли и наличием метастатического поражения лимфоузлов
[61]. В работе Teschendorff A.E., Lee S.H., Jones A. и др. (2015) повышение экспрессии HOTAIR в опухоли яичников было ассоциировано с резистентностью к карбоплатину, но не к цисплатину; блокада HOTAIR подавляет пролиферацию и инвазивные способности цисплатин-резистентных клеток SKOV-3, одновременно стимулируя в них платиноиндуцированный апоптоз [101]. На клетках опухолей различных локализаций, в том числе РЯ [70], продемонстрирована роль HOTAIR
в запуске ЭМП и приобретении стволовых свойств. Существует взаимосвязь между гиперэкспрессией маркера стволовых клеток различных опухолей
ALDH1A1 и HOTAIR [14]. В платинорезистентных клетках рака желудка
HOTAIR провоцирует экспрессию VEGFA и активацию сигнального пути
PI3K/AKT/MRP1 посредством miR-126 [134]. К другим возможным механизмам действия HOTAIR в контексте платинорезистентности относятся регуляция экспрессии р21 [226], активация МАРК [100], а также индукция аутофагии [124].
Интересно, что HOTAIR способна влиять на процессы образования активных форм кислорода [177], играющие важную роль в развитии эффектов платиновых препаратов.
Экспрессия PlasmacytomaVariantTranslocation 1 (PVT1) повышена в опухолях РЯ, резистентных к цисплатину, в сравнении с чувствительными;
механизм действия PVT1 при этом может заключаться в регуляции экспрессии
TGF-β1, p-Smad4 и каспазы-3 [162]. PVT1 в процессе канцерогенеза действует синергично с онкогеном myc [176], имеющим значение в платинорезистентности РЯ [212]. Invitroпроапоптотический эффект при РЯ показан именно для блокады
PVT1, тогда как воздействие на MYC вызывало только снижение пролиферации
[18]. Исследований роли PVT1 в канцерогенезе РЯ немного, результаты их
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
36
противоречивы и большинство из них проводились на клеточных линиях [131, 138].
MALAT1 также проявляет онкогенные свойства в отношении РЯ. Одной из мишеней MALAT1 является ген р53, играющий ключевую роль в канцерогенезе РЯ [137]. Возможные механизмы воздействия MALAT1 на канцерогенез включают стимуляцию приобретения клеткой стволовых свойств за счет активации сигнальных путей PI3K/AKT [64], Wnt/β-catenin [142], MAPK [143];
стимуляцию опухолевого ангиогенеза [143]. HOTAIR и MALAT1 также считаются lncRNA, провоцирующими опухоль-ассоциированное воспаление – в
частности, при синергичном воздействии с транскрипционным фактором NF- B [135]. NF- B может связываться с промотором гена HOTAIR и индуцировать экспрессию этой lncRNA в клетках РЯ. Формируется каскад с положительной обратной связью, стимулирующий выживание клетки [153].
Несколькими авторами предложены различные панели экспрессии lncRNA,
а также коэкспрессииlncRNA и соответствующих мРНК [84], ассоциированные с ответом на платиносодержащую терапию при РЯ [12, 136]. Очевидно, что РЯ связан с определенными эпигенетическими изменениями, и такие lncRNA, как
MALAT1, HOTAIR в опухолевой ткани имеют онкогенную функцию. В то же время в доступной литературе мы не обнаружили данных об экспрессии вышеописанных lncRNA при раке яичников в сыворотке крови, где они теоретически могли бы влиять на поведение ЦОК, а также циркулирующих иммунных клеток, также внося вклад в опухолевую прогрессию.
1.6. Циркулирующие медиаторы воспаления в прогрессировании рака
яичников
Как и все злокачественные новообразования, согласно понятию о ключевых признаках рака [97], рак яичников ассоциирован с воспалением. Локальное и системное воспаление играет роль в инициации опухоли [112] и ее прогрессии.
Все больше данных генетических исследований предполагают, что стволовость -
скорее функциональное состояние опухолевой клетки, чем специфический
37
клеточный подтип [54]. В данном случае роль микроокружения опухолевой клетки и его сигналов становится критической в определении судьбы клетки.
Медиаторы воспаления - цитокины, хемокины, факторы роста – не только запускают определенные сигнальные пути внутри атипичной клетки, но и опосредуют «взаимоотношения» опухолевой паренхимы и стромы.
В системном кровотоке источником медиаторов воспаления могут быть различные клетки, в том числе как собственно иммунные клетки, так и клетки опухолевых очагов (особенно при распространенном заболевании). Изменения концентраций медиаторов в периферической крови у онкологических пациентов могут приводить ко множеству эффектов: от развития кахексии, существенно сокращающей продолжительнось жизни пациента, до регуляции рекрутинга иммунных клеток в опухолевый очаг, а также выбора мест экстравазации ЦОК
(как компонент теории семени и почвы). Цитокины и факторы роста формируют в очаге РЯ иммуносупрессивную нишу, способствующую проявлению стволовых свойств атипичных клеток, проопухолевой поляризации клеток иммунного инфильтрата, ангиогенезу [221]. Большое значение в развитии перитонеальной диссеминации рака яичников придают макрофагам, провоцирующим инвазию злокачественных клеток путем секреции IL-6, IL-8, IL-10, TGF-β, CCL18, CCL22, VEGF и других растворимых медиаторов воспаления, в высокой концентрации определяющихся в асцитической жидкости, но также присутствующих и в плазме крови. Цитокин-опосредованное взаимодействие, а также передача экзосом от опухоль-ассоциированных макрофагов клеткам РЯ приводят к снижению химиочувствительности последних. Кроме того, цитокины регулируют привлечение в опухоль нейтрофилов [188]. В свою очередь, нейтрофилы в процессе опухолевой прогрессии способны поляризоваться и приобретать проопухолевый фенотип. Проопухолевые нейтрофилы играют роль иммуносупрессора, подавляя Т-клеточный ответ с помощью механизма, не затрагивающего контрольные точки-мишени наиболее распространенных иммунопрепаратов [150].
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
38
Ряд крупных исследований демонстрируют предиктивный и прогностический потенциал различных воспалительных индексов и уровней цитокинов периферической крови при РЯ. Например, прогностическая шкала Глазго, учитывающая содержание в крови С-реактивного белка, имеет признанную прогностическую ценность в отношении ОВ при раке яичников [92].
Содержание IL-6 в крови потенциально может служить предиктором эффективности добавления бевацизумаба к цитостатической ХТ [168].
Сывороточные концентрации IL-6, IL-8, IL-10, IL-22, TNF-альфа, экспрессия
CXCR2 на нейтрофилах периферической крови имеют потенциальное значение в дифференциальной диагностике РЯ и доброкачественных опухолей яичников
[197]. Экспрессия мРНК IL-17 повышена в мононуклеарной фракции периферических лейкоцитов при РЯ в сравнении со здоровыми людьми [117].
Высокое содержание циркулирующего IL-37 является независимым фактором неблагоприятного прогноза РЯ [71]; снижение ОВ наблюдалось и при повышенной экспрессии в крови IL-6 [190]. В другом исследовании были найдены различия в экспрессии хемокинов между пациентками с платино-
резистентными и платино-чувствительными опухолями; к ним относились CCL2, CCL4, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL8, IL-18 [40]. В то же время данных о клинической значимости концентраций различных цитокинов в крови и асцитической жидкости при РЯ недостаточно. Лишь высокий уровень VEGF в
сыворотке крови до операции и в опухолевой ткани может считаться маркером неблагоприятного прогноза.
Существуют исследования, показывающие корреляции между содержанием различных цитокинов в крови и числом ЦОК при других локализациях опухолей
[113]. Природа таких корреляций точно не установлена: это может быть проявлением воспалительного ответа организма на опухолевую прогрессию в целом, либо усиленного проивзодства цитокинов опухолевыми клетками, либо иммунными клетками, непосредственно стимулированными взаимодействием с ЦОК [198]. Очевидно, однако, что некоторые цитокины способны подготавливать для выжившей в кровотоке доли ЦОК преметастатическую нишу [132],
39
привлекать клетки в нее [63] и способствовать их трансэндотелиальной миграции в ткань [180]. ЦОК могут экспрессировать рецепторы для хемокинов, например,
при раке молочной железы экспрессия в них CX3CR1 повышает число клеток,
уходящих из кровотока в ткани; подавление CX3CR1 заставляет ЦОК оставаться в кровотоке на более длительный срок и повышает вероятность их гибели от аноикиса [109].
Таким образом, периферическая кровь пациенток с раком яичников содержит самые разнообразные клеточные и молекулярные маркеры,
потенциально участвующие в опухолевой прогрессии, развитии химиорезистентности или ответа на терапию. При этом резистентность к платиновым препаратам, являющаяся огромной проблемой в терапии РЯ, до настоящего времени не имеет четкого критерия, основанного на молекулярных и клеточных параметрах. Кроме того, все больше данных свидетельствует о высокой гетерогенности злокачественных опухолей яичников, но стратификация пациенток на прогностические группы в момент первичной диагностики болезни остается затруднительной. Существующие валидизированные прогностические модели в основном строятся на клинических факторах, за исключением уровня СА-125, а также наличия дефицита в системе гомологичной рекомбинации,
тестирование которого не всегда доступно. Возможно, что угубленное исследование параметров периферической крови позволит сместить акцент на индивидуализацию терапевтического подхода с учетом биологических особенностей опухоли, используя малоинвазивную методику.
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
40
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Диссертационное исследование выполнено на базе OpenLab «Генные и клеточные технологии» Института Фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) Федеральный Университет», Центра Медико-биологических Исследований НИТИ им. Капицы Ульяновского государственного университета и гинекологическогоотделенияГУЗ «Областной клинический онкологический диспансер» г. Ульяновска в период 2017-2021 годы.
На проведение исследования получено разрешение этического комитета ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный университет» Института медицины, экологии и физической культуры Министерства образования и науки Российской Федерации Министерства образования и науки Российской Федерации от 15.03.2017г. протокол №3. От всех пациенток, включенных в исследование, было получено письменное добровольное информированное согласие на участие в исследовании, соответствующее принципам, изложенным в Хельсинкской декларации (2013).
В квалификационное исследование были включены сведения о 145 пациентках с опухолевыми образованиями яичников, проходивших лечение в гинекологическом отделении ГУЗ «Областной клинический онкологический диспансер» г. Ульяновска в 2017-2021 гг.
Критериями включения в исследование являлись:
-женщины в возрасте старше 18 лет;
-впервые выявленная злокачественная эпителиальная опухоль яичников;
-гистологическая либо цитологическая верификация диагноза;
-отсутствие в анамнезе других злокачественных опухолей, за исключением тех, у которых срок ремиссии составлял >5 лет после радикального лечения;
-отсутствие острых и хронических в стадии обострения сопутствующих заболеваний любой этиологии.
Критерии исключения из исследования: