89

Глава 5. Клеточный мониторинг озона.

биоиндикаторы

Эффективность действия озона определяется уровнем его содержания в воздухе. Для оценки концентрации озона и продолжительности его действия на живые объекты обычно используется понятие дозы. Наименьшая доза, способная вызвать эффект, называется пороговой. Чем меньше доза, необходимая в ряду исследуемых видов, тем более чувствительным считается вид. Различают чувствительные, промежуточные и толерантные виды организмов. Организмы обладают высокой чувствительностью к озону. Эффекты О₃ могут быть как острыми (при высокой концентрации газа за короткий промежуток времени- несколько минут или часов) или хроническими (при низких концентрациях за продолжительный период времени - часы и сутки). Таким образом, чувствительность живых клеток зависит от дозы озона.

В связи с большой опасностью для живых организмов высоких концентраций тропосферного озона индикация повреждений, им вызванных, представляет важную задачу. Решение ее имеет фундаментальное значение для прогнозирования жизнедеятельности клеток в условиях пониженного или повышенного содержания озона. Физико-химические методы определения озона в воздухе не дают ответа, какие именно повреждения происходят в живых клетках под его влиянием, что важно для выявления степени повреждения, а только точно фиксируют концентрацию озона в воздухе в данный момент времени. Поиск чувствительных биоиндикаторов составляет предмет усилий исследователей во всех странах Мира. Неслучайно для выявления загрязнения среды антропогенным озоном законодательство во многих странах Мира по вопросам защиты окружающей среды основано именно на успешном применении биоиндикаторов для определения эффекта воздействия этого газа на организмы.

5.1. Чувствительность клеток к озону. Различия в чувствительности организмов

В основе биоиндикации лежит поиск чувствительных клеток и организмов. Клетки разных организмов и отдельные клеточные реакции обладают разной чувствительностью к О₃. Наиболее чувствительной реакцией при остром воздействии является стимуляция деления ядра у ряда организмов. При хронической экспозиции в озоне даже небольшие дозы могут вызывать хромосомные аберрации. Низкие дозы озона вызывают синтез флавоноидов и хлорофилла у растений и синтез цитокинов у животных. При средних концентрациях озона можно наблюдать реакции повышения проницаемости мембран и появление желтой флуоресценции клеток, связанной с образованием флуоресцирующих продуктов перекисного окисления липидов. Высокие концентрации озона за короткое время, как и длительные воздействия низкими концентрациями, могут приводить к угнетению основных метаболических процессов – фотосинтеза у растений и дыхания у всех организмов. Далее следуют программированная смерть клетки (апоптоз у многоклеточных организмов, часто с видимым повреждением только ядра) или гибель любых клеток, называемая некрозом (многочисленные повреждения цитоплазмы и всех органелл).

Для выбора биологического индикатора важно найти особо чувствительную реакцию, которую можно фиксировать еще до видимых признаков летального повреждения. Это полезно для ранней диагностики озоновых эффектов.

Микроорганизмы. Клетки микроорганизмов могут утрачивать способность к формированию колоний, и их дыхание заметно подавляется при дозах выше 2-3 мкмоль озона на 1мг мембранного белка. Установлен двухфазный характер действия озона на микробные клетки. Например, у дрожжевых клеток низкие дозы озона стимулируют Н-АТФ-азу, дыхание и репродуктивную способность, а высокие – их ингибируют, что приводит в конце концов к гибели клеток. В высоких дозах озон обладает мощными окислительными свойствами, обеспечивающими бактерио-, фунги- и вирицидный эффект. Озон способен убивать все известные виды грамм положительных и грамм отрицательных бактерий, включая синегнойную палочку и легионеллу, все липофильные и гидрофильные вирусы, включая вирусы гепатита А, В и С и ВИЧ, споры и вегетативные формы всех известных патогенных грибов. При этом в отличие от многих известных антисептиков озон, как токсикант, действует на микроорганизмы в более низких концентрациях, чем на млекопитающих. Однако многие микроорганизмы для использования в качестве индикаторов на озон не годятся, поскольку часто их реакции на О₃ связаны с трудно наблюдаемыми нарушениями метаболизма и быстрой гибелью клеток.

Животные. У многих животных (наиболее чувствительны млекопитающие) обнаружена стимуляция клеточных реакций иммунной системы при воздействии низкими дозами озона и, напротив, угнетение легочной функции в его высоких дозах. Найденные закономерности уже применяют в практике.

Например, для млекопитающих делаются попытки использовать озон в медицинских целях. Терапевтические дозы озона составляют около 6-10 мг/л для лабораторных животных, а более высокие концентрации ведут к угнетению дыхания и повреждению легочной ткани. Положительное действие озона на млекопитающих (иммуномодулирующий эффект озонотерапии) проявляется в том, что этот газ обеспечивает усиленное поступление кислорода к тканям, и такого эффекта невозможно достичь ни одним из известных фармацевтических препаратов. Озон регулирует все стадии фагоцитоза – ускоряет хемотаксис, сокращает время адгезии, активирует переваривающую способность фагоцитов. Показано также, что озон стимулирует выработку цитокинов (интерфероны, интерлейкины, фактор некроза опухолей альфа) лимфоцитами и моноцитами, а также оказывает модулирующее воздействие на уровень иммуноглобулинов и иммунных комплексов в плазме крови. Несмотря на заметные повреждающие эффекты высоких концентраций озона, делаются попытки использовать этот газ и в онкологии для уничтожения раковых клеток.

Среди животных организмов наиболее чувствительными объектами к озону оказались крысы, у которых наблюдается заметное воспаление легких при высоких концентрациях озона в воздухе, что может служить диагностическим признаком. Однако затраты на уход в специальных вивариях и проблема вивисекции для диагностики затрудняют использование животных в качестве биоиндикаторов.

Растения. У растений различные концентрации озона в диапазоне 0.1 – 2 мкл/л вызывают реакции – от стимулирования процессов (при низких концентрациях) до нарушения роста и появления некротических и пигментных пятен (при высоких концентрациях). По сравнению с клетками микроорганизмов и животных, у растений можно наблюдать более отчетливые изменения метаболизма, например образование под действием высоких концентраций озона характерных пятен - белых - у листьев петрушки или цветных, красных - у листьев фасоли. Визуальные признаки повреждения особенно легко заметны, что делает растения индикаторами в экологическом биомониторинге.

Поскольку растения обладают относительно высокой чувствительностью к озону, они могут использоваться не только в качестве индикаторов на О_3, но и для определения его уровня в воздухе. Для этого необходимо, чтобы существовали заметные озоновые эффекты на растения и результаты были легко воспроизводимы. Кроме того, реакция именно на озон должна отличаться от эффектов, вызываемых другими загрязнителями атмосферы.

Размножение растений всегда чувствительно к любому стрессу. Озоновый стресс не является исключением. Он проявляется на всех стадиях от цветения и оплодотворения до развития плодов и семян. Наиболее наглядно образование цветков и плодов при хронических экспозициях в озоне. Давно замечено, что озон изменяет соотношение между образованием цветков, формированием плодов и листьев. Так образование плодов в фумигированных озоном (0,12-0,20 часть/млн в течение 106 дней) растениях перца Capsicum annuum снижается образование плодов на 54%. В фазу цветения при долговременных хронических экспозициях в озоне у петунии Petunia, герани Geranium, гвоздики Dianthus снижается число цветков.

Симптомы повреждения листьев, измененный рост и репродукция, изменения урожая и продуктивности, а также нарушения в обычном распространении отдельных видов растений по фитоценозам сами по себе или в комбинации с другими методами мониторинга могут служить диагностическими признаками озонового загрязнения.

На клеточном уровне реакции на озон лучше всего изучены у растений, поэтому основными модельными системами для исследований влияния озона являются именно растительные клетки. Более того, растительные клетки используются как биоиндикаторы на озон, особенно при хроническом воздействии озона в естественных и урбанизированных местах обитания организмов. При этом могут анализироваться разные показатели повреждения растений как на уровне отдельной клетки или ткани, а также целого организма. Чувствительность клеточных процессов будет зависеть от действующей концентрации озона, видовых и сортовых особенностей, определяемых геномом в целом или экспрессией отдельных генов, и других внешних и внутренних факторов среды (см. Приложение 3).