Технология получения вирусной вакцины против гепатита в
Куриные эмбрионы заражают в аллантоисную жидкость вирусом осповакцины, экспрессирующей поверхностный антиген HBsAg. Выдерживают эмбрионы при 37ºС в течение 72 ч. Затем охлаждают при 4– 5ºС в течение 18 ч. Затем их вскрывают и в асептических условиях собирают аллантоисную жидкость. Методом иммуноферментного анализа определяют содержание в ней антигена HBsAg, которого должно быть не менее 300 нг/мл. Аллантоисную жидкость пропускают через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Проводят концентрирование раствора. К концентрированному раствору добавляют фосфатный буферный раствор с рН 7,2 с натрия хлоридом и проводят диафильтрацию (ультрафильтрация с разделением хорошо и плохо задерживаемых мембраной компонентов). Проводят контроль на отсутствие вируса. Очистку проводят иммуноафинной хроматографией на сефарозе 4В, на которой адсорбированы анти-Hbsантитела сыворотки крови козы. Десорбцию с колонки проводят фосфатно-цитратным буфером с рН 2,2.
3. Стандартизация вакцин
При стандартизации вакцин учитываются такие показатели, как: описание, подлинность, растворимость, прозрачность, цветность, механические включения, рН, содержание белка, стерильность, токсичность, специфическая активность, специфическая безопасность, антигенная активность, пирогенность, упаковка, маркировка, транспортирование, хранение, срок годности, назначение.
Подлинность вакцины проверяется в реакциях идентификации микробного компонента. Путем окраски и просматривания препаратов под микроскопом.
Специфическая активность (иммуногенность) – необходимый минимальный титр микробного компонента в прививочной дозе.
В спецификации убитых вакцин должно быть указано содержание инактивирующих агентов (формалин) и консервантов. Если для получения вакцины использовалась клеточная культура (культуральная вакцина), необходим контроль содержания бычьего сывороточного альбумина (компонент питательной среды). Специфическая безопасность подразумевает контроль полноты инактивации, отсутствие остаточной вирулентности, генетическую стабильность. Специфическая активность вакцин – количество АГ в единице объема; количество живых или убитых микробных клеток, составляющих основу вакцины; уровень специфических АТ в сыворотке крови иммунизированных животных.
Специфическая безопасность вакцин. Вакцина не должна содержать живых вирулентных микроорганизмов. Проводят испытание на первичной культуре клеток почек сирийских хомячков. Используют среду 199 на растворе Хенкса с добавлением 10 % сыворотки крупного рогатого скота. Культивируют при температуре 37ºС в течение 5–6 суток. Затем среду сливают, вносят раствор Эрла и гидролизат лактальбумина, добавляют 5 % сыворотки крупного рогатого скота и гентамицина сульфат. На 7–8 сутки инкубации при 32ºС берут пробу культуральной жидкости и вводят 10 мышам. При заболевании хотя бы одной мыши вакцину бракуют.
Количественное определение адсорбированной дифтерийной вакцины (ГФ РБ, статья 2.7.6)
Активность дифтерийной вакцины определяется путем назначения вакцины морским свинкам с последующей провокацией дифтерийным токсином (методы А или В) или путем определения титра антител против дифтерийногo токсина или анатоксина в сыворотке крови морских свинок (метод С). В обоих случаях активность вакцины рассчитывается по сравнению со стандартным образцом, калиброванным в Международных Единицах.
Метод А. Внутрикожный провокационный тест на морских свинках. Используют здоровых морских свинок из одной партии. Животных распределяют не менее чем на 6 равных групп по 5 голов в каждой. Готовят по 5 разведений раствора стандарта и исследуемого раствора с шагом не более 2,5 раза.
Иммуниация и провокация. Назначают по одному разведению одной группе морских свинок и вводят подкожно по 1,0 мл разведения каждой морской свинке в группе. Спустя 28 дней каждой свинке выбривают оба бока и вводят внутрикожно по 0,2 мл каждогo из 6 разведений токсина в 6 различных мест на коже животного так, чтобы минимизировать влияние соседних инъекций.
Все места инъекций обследуют через 48 часов и записывают наличие специфической дифтерийной эритемы (покраснение). Записывают также число мест инъекций без реакции (внутрикожный провокационный индекс). Сравнивают индекс исследуемого и стандартного растворов.
Метод В. Летальный провокационный тест на морских свинках. Используют здоровых морских свинок из одной партии весом 250-350 г. Животных одного пола распределяют в 6 равных групп.
Назначают по одному разведению одной группе морских свинок и вводят подкожно по 1 мл разведения каждой морской свинке в группе. Спустя 28 дней каждой свинке вводят подкожно по 1 мл раствора токсина. Считают число выживших животных спустя 4 дня после инъекции токсина. Рассчитывают активность испытуемой вакцины по отношению к активности стандартною образца на основании пропорции выживших животных в каждой группе вакцинированных морских свинок.
Метод С. Определение антител у морских свинок. Готовят не менее трех разведений с 2,5–5-кратным шагом. Каждой свинке вводят подкожно 1,0 мл разведения, предназначенного для данной группы животных. Через 35–42 дня после иммунизации подходящим методом берут образцы крови у каждого вакцинированного и контрольного животного. Подходящим иммунохимическим методом определяют содержание антител.
Определение титра антител
Приведенные ниже твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА ELISA)) и Vero-Tecт являются примером иммунохимических методов, признанных подходящими для определения титра антител.
Определение титра антител в сыворотке морской свинки с помощью тИФА. Лунки используют для исследуемых сывороток, отрицательного и положительного контролей. Покрывают лунки планшета для тИФА 100 мкл раствора дифтерийноro анатоксина. Планшет оставляют на ночь при температуре 4ºС во влажной камере. На следующий день пластины тщательно отмывают промывочным буферным раствором.
Готовят подходящие разведения отрицательной и положительной контрольных сывороток и испытуемых сывороток. Инкубируют при температуре 37ºС в течение 2 ч. Oтмывают промывочным буферным раствором. Готовят подходящее разведение конъюгата пероксидазы в блокирующем буферном растворе и прибавляют по 100 мкл в каждую лунку. Инкубируют при температуре 37ºС во влажной камере в течение 1 ч. Отмывают планшет промывочным буферным раствором. Прибавляют по 100 мкл субстратногo раствора в каждую лунку. Инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин. Учитывают реакцию при длине волны 405 нм.
Определение титра антител в сыворотке морской свинки с помощью Vero-теста. Метод основан на регистрации угнетения метаболизма (1) или цитотоксичности (2) в качестве конечногo эффекта. Регистрация может быть выполнена путем микроскопии клеток (определение клеточной морфологии) или макроскопически (по изменению цвета). Конечная точка метода может быть определена как максимальное разведение сыворотки, которое защищает клетки от дифтерийногo токсина. Активность антитоксина рассчитывается по сравнению с референтной сывороткой морской свинки или стандартным образцом ВОЗ и выражается в МЕ/мл.
Метод 1. Дифтерийный токсин оказывает цитопатическое действие (ЦПД) на клетки Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки) и их лизис. Антитела против токсина могут нейтрализовать указанное ЦПД. Следовательно, активность дифтерийной вакцины можно определить с помощью описанной культуральной клеточной системы, если добавлять в культуру различные разведения сыворотки от иммунизированных животных и фиксированное количество токсина. При проведении Vero- тестa желтый цвет среды указывает, что клетки живые; красный – что клетки погибли. В случае гибели части клеток цвет среды может быть оранжевым.
Метод 2. Тиазолил синий МТТ восстанавливается в сине-черный формазан митохондриальными дегидрогеназами живых клеток и, следовательно, может быть использован для количественной оценки присутствия живых клеток, указывая на степень нейтрализации токсина антитоксином. Белые или бесцветные лунки указывают на отсутствие живых клеток вследствие недостаточной нейтрализации токсина.
Количественное определение вакцины гепатита В (рДНК) (ГФ РБ, статья 2.7.15)
Количественное определение вакцины гепатита В (рДНК) производят либо in vivo, путем сравнения ее способности приводить в данных условиях к образованию специфических антител против поверхностного антигена гепатита В (HbsAg) у мышей или морских свинок с такой же способностью стандартного образца, либо in vitro, путем иммунохимическогo определения содержания антигена.
Определение in vivo. В испытании используют здоровых мышей из одной партии возрастом около 5 недель. Также могут использоваться здоровые морские свинки из одной партии с массой тела от 300 до 350 г и возрастом около 7 недель. Используют животных одною пола. Животных делят не менее чем на семь равных групп.
Готовят не менее трех разведений вакцины и стандартного образца. Каждое из полученных разведений назначают одной из групп животных, каждому из которых вводят внутрибрюшинно не более 1,0 мл данного разведения. Одну группу животных не вакцинируют, а вводят внутрибрюшинно такой же объем растворителя. Через подходящий промежуток времени (например, от 4 до 6 недель) всех животных анестезируют и производят забор крови. Выполняют количественное определение специфических антител против HBsAg в индивидуальных сыворотках, используя подходящий иммунохимический метод.
Определение in vitro. Выполняют иммунохимическое определение содержания антигена. Показано, что методы твердофазногo иммуноферментного анализа (тИФА, ELISA) и радиоммунологическоro анализа (РИА) с использованием моноклональных антител, специфичных к индуцирующим защитную реакцию эпитопам HBsAg, являются подходящими. Используют соответствующее число разведений испытуемой вакцины и стандартного средства.