7.3.2. Метод спінових міток (спінових зондів)

Для вивчення структури і функцій біологічних мембран з успіхом застосовується метод спінових міток, або спіно­вих зондів.

Пояснимо суть цього методу. Похідну стійкого вільного радикала, частіше нітроксильного, пов'язують ковалентним зв'язком з будь-якою функціональною групою білка або ліпіду, а потім таку спін-мічену молекулу вбудовують в ліпідний бішар мембран, утворюючи так званий "спіновий зонд". Форма сигналу спінової мітки залежить від оберталь­ної рухливості зонда або тієї його ділянки, до якої вона "пришита" (рис.7.6).

Рис. 7.6. Форми сигналу спінової мітки в залежності від рухливості

зонда.

Використання методу спінових зондів дало можливість встановити цілий ряд цікавих фактів.

Рис. 7.7. Спінові зонди - спін-мічені аналоги стеаринових кислот.

1. Використовуючи в ролі спінових зондів спін-мічені аналоги стеаринових кислот і вводячи їх в оболонки еритро­цитів (рис. 9.28), довели, що відносно жорсткий порядок поширюється на глибину не більш ніж вісім вуглецевих атомів ланцюга від поверхні в глибину мембрани. У на­прямку до центра ліпідного бішару рухливість жирно-кислотних ланцюжків зростає. Оцінка обертальної рухливості дала можливість встановити, що мікров'язкість ліпідного бішару в мембрані еритроцита приблизно дорів­нює в'язкості рослинної олії.

2. Аналогічним чином, шляхом введення в біологічні мембрани спін-мічених жирних кислот або синтезованих на їх основі фосфоліпідів було виявлено зміну структури мембрани при різних випадках патології, а також під дією ліків та інших біологічно активних сполук. Так, було показано, що анестетики збільшують плинність всередині ліпідного бішару мембрани, а холестерин і ДДТ зменшу­ють її.

3. Методом ЕПР було вперше експериментально дове­дено існування фосфоліпідного перевороту. Був виявлений повільний фосфоліпідний переворот в мембран­них везикулах-ліпосомах, або фосфоліпідних бульбашках (рис. 7.8). Саме таким переворотом можна пояснити меха­нізм пасивного транспорту деяких іонів через біологічні мембрани.

Рис. 7.8. Фосфоліпідний переворотв мембранах.

7.3.3. Спін-імунологічний метод

Найпершим клінічним застосуванням методу спінових міток був спін-імунологічний метод (СІМ), вперше описа­ний в літературі у 1972 р. Цей метод дає змогу встановити малі кількості біологічно активних речовин (наприклад, наркотичних речовин) у рідинах організму (сечі, слині, крові). Метод, заснований на витісненні міченої сполуки неміченою, якщо вона присутня в розчині, з її комплексу із специфічним антитілом та вимірюванням кількості витіс­неної мітки.

СІМ складається з трьох етапів:

а) синтез спін-міченої моделі даної біологічно-активної сполуки;

б) одержання специфічних антитіл проти даної речови­ни;

в) визначення за допомогою комплексу спін-міченої сполуки з антитілом вмісту шуканої біологічно активної речовини у біологічних рідинах.

Яким же чином здійснюється якісний і кількісний ана­ліз на біологічно активну речовину? При зв'язуванні спін-міченого морфіна з молекулою антитіла його обертання стає дедалі повільнішим, і спектр стає характерним для імобілізованого радикала (рис. 7.9а).

Рис. 7.9. Ілюстрація спін-імунологічного методу.

Якщо тепер цей комплекс помістити в середовище, що вміщує морфін або споріднені йому сполуки, які мають більшу константу зв'язку з антитілами, то спін-мічений морфін буде підлягати обміну і витіснятись із комплексу з антитілом, при цьому спектр ЕПР буде змінюватись на характерний для незв'язаного радикала (мал. 7.306). Ця зміна піддається оцінці і дає змогу визначити концентрацію морфіноподібних сполук у розчині.