Вирусология

Фаги получают путем фильтрации лигированных ими бульонных культур бактерий через бактериологические свечи Шамэерлана и фильтры Зейтца. Готовый препарат фага представляет собой прозрачную желтоватую жидкость. В целях повышения лабильности фильтрат фаголизатов таблетируют и покрывают кислотоустойчивой оболочкой из ацетилцеллюлозы (рисунок 35).

ÏолесÃÓ

Рисунок 35 – Определение титра бактериофага

Более точные данные об активности фага получают, определив количество активных фаговых корпускул в единице объема.

1. Разные разведения фага засевают в две параллельные чашки Петри

61

2. Инкубируют в термостате 18 ч.

Подсчитывают количество негативных колоний, умножая на разведение. Например, при исследовании по методу Грациа на чашках, в которые вносили 1 мл фага в разведении 107, было обнаружено 25 колоний. Следовательно, титр фага (количество корпускул в 1 мл) равен 25 х 107, или

2,5х108

Техника выделения вирулентного фага.

1.исследуемый жидкий материал центрифугируют.

2.1 мл надосадочной жидкости переносят в 30 мл мясо-пептонного

бульона (МПБ), засеянного 1 мл 6-18-часовой культуры соответствующего

культуройÏолесÃÓбактерий (контроль за наличием в ней фага), во вторую наливают фаг (контроль его стерильности).

микроорганизма.

3. Посев инкубируют в термостате (37 °С, 1 сут.) 4. Пропускают через фильтр Зейтца.

5. Фильтрат разводят 1:10, 1:100, 1:1000

6. Прибавляют по 0,05 мл культуры.

7. Контрольной служит бульонная культура без фильтрата. 8. Помещают в термостат на 18-20 ч.

7. Инкубируют в термостате 18-24 ч.

Титр фага – наибольшее его разведение, в котором наблюдается полный лизис бактерий.

62

Таблица – Схема титрования фага по Аппельману

мясопептонный агар (МПА) как подложку: чашки Петри с 20-25 мл 1,5% МПА, покрытые стерильной бумагой, выд рживают под бактерицидной лампой в течение неско ьких часов, зат м закрывают крышками и оставляют до следующего дня при комнатной т мп ратуре.

2. 1 мл испытуемого фи ьтрата, разведенного бульоном 1:10, 1:100, 1:1000, и 0,1 мл фаг чувствите ьной ку ьтуры бактерий поочередно вносят в пробирку с 2,5 мл расп ав енн го 0,7% агара и, хорошо перемешав ее содержимое, выливают в чашки Петри на поверхность подготовленного 1,5% агара.

3. После равн мерн го распределения смеси для уплотнения полужидкого агара чашки Петри оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

4. Помещают в термостат (37 с на сутки)

При небольшом количестве корпускул фага в бактериальном газоне обнаруживаются отдельные негативные колонии, при большой концентрации фага - диффузный или даже сплошной лизис культуры (рисунок 36).

63

Рисунок36 – Титрование по Грациа

В облученномÏолесÃÓпосеве обнаруживают литический эффект действия вегетативных фагов.

Титр фага выражают максимальным разведением, в котором проявляется его литическое действие .

3.2Получение фаговых лизатов

Фаголизат - суспензия бактериофага, полученная после лизиса зараженных фагом клеток бактерий. Для получения фаголизатов можно

использовать как жидкие, так и агаризованные питательные среды.

Техника получения фаговых лизатов

1. В бульонную культуру бактерий E.coli B вносят 1-2 мл фаговой суспензии, либо касаются бактериальной петлей изолированной негативной колонии и эмульгируют ее в питательном бульоне.

2. Инкубируют в термостате до просветления суспензии.

3. Фаголизат освобождают от бактериальных клеток одним их следующих способов:

1) фильтрованием через мембранный фильтр;

64

2)центрифугированием для осаждения клеток (6000 об/ми, 10 мин);

3)обработкой фаголизата хлороформом в соотношении 10:1 с последующим энергичным встряхиванием в течение минуты, инкубированием

втечение часа при комнатной температуре и центрифугированием.

Техника получения фаголизатов бактериофагов Т-группы в жидкой питательной среде

1. 18-24 часовую культуру чувствительных к фагу бактерий (E. Coli В) засевают в жидкую питательную среду в соотношении 1:10.

2. Культивируют с аэрированием (37о С, 2,5 - 3 ч) до логарифмической

фазы роста в течение (до плотности 2х108 кл/мл).

чувствительныхÏолесÃÓбактерий E. Coli B в огарифмической фазе роста и 1 мл суспензии одного из фаг в Т-группы (конечная концентрация 104 - 105 частиц/

3. В бактериальную культуру добавляют суспензию фага с таким

расчетом, чтобы множественность инфекции составляла 1.

4. Продолжают инкубирование (6 - 8 часов) с аэрацией до просветления

бактериальной культуры.

5. Фаголизат освобождают от бактерий низкоскоростным центрифугированием (6000 об/мин, 10 мин) или фильтрованием через бактериальные

фильтры и определяют титр полученного фага.

В жидкой среде можно получать большие объемы фаголизатов с

содержанием фаговых частиц около 5 х 109 ча тиц/мл.

Техника получения фаголизата бакт риофагов Т-группы на агари-

мл), 2. Перемешивают и выливают на поверхность 1,5 % агаризованной

питательной среды в чашках Петри. Таким образом проводят засев нескольких чашек.

3. Чашки инкубируют в течение 18 - 20 часов.

4. В каждую из них вносят 5 мл физиологического раствора или жидкой питательной среды и шпателем осторожно снимают верхний (0,7%) слой агара.

5. Для удаления бактерий и остатков агара полученную массу центрифугируют (6000 об/мин, 10 мин).

6. После серии разведений полученного фаголизата определяют титр фага.

Экспериментально выявлено, что на плотной питательной среде количество полученного фаголизата оказывается меньше, чем в случае приготовления его в жидкой питательной среде, но титр бактериофага в этом

65

случае несколько выше - 109 - 1011 частиц/мл.

Спектр литического действия бактериофага – это способность бактериофага заражать и вызывать лизис определенного круга бактерий. По наличию бактериофагов, например, в воде, можно косвенно судить о присутствии в ней тех или иных бактерий, которые являются для них хозяевами. Определение спектра литического действия используют при эпидемиологическом анализе вспышек инфекционных заболеваний. Исследование спектра литического действия фага может быть полезно при определении пути попадания данного фага на производство, а также при выборе способов придания клеткам признака фагоустойчивости.

Спектр литического действия фага можно охарактеризовать по индексу чувствительностиÏолесÃÓкультур - доли бактериальных культур, лизирующихся данным фагом, по отношению к общему числу испытанных штаммов. Например, если из 10 испытанных культур фагом лизируется 4, то можно говорить, что индекс чувствительности культур к данному фагу равен 0,25. Этим показателем можно пользоваться при сравнении спектров литического действия нескольких фагов.

Техника определения спектра литиче кого дей твия фага

Определить спектр литич ского д й твия можно несколькими способами.

Способ 1 1. На поверхность 1,5 % агаризованной питательной среды в чашке

Петри с помощью бактерио огич ской п тли наносят культуры исследуемых бактерий медальонами.

2. В центр кажд го меда ьона с помощью пастеровской пипетки наносят каплю суспензии с исс едуемым фагом.

3. Чашки п мещают в терм стат (28оС, 24 ч.).

О спос бн сти тестируем го фага вызывать лизис исследуемых бактерий судят по наличию з н лизиса в местах нанесения суспензии фага.

Способ2 1. На поверхность 1,5 % агаризованной среды в чашке Петри пипеткой

наносят каплю суспензии с исследуемым фагом, втирают с помощью шпателя.

2. На поверхность агаризованной среды наносят каплями исследуемые бактериальные культуры в стационарной фазе роста.

3. Чашки помещают в термостат (28 С, 24 ч.).

О способности тестируемого фага вызывать лизис исследуемых бактерий судят по отсутствию роста чувствительных к исследуемому фагу бактерий.

Способ 3 1. На поверхность 1,5 % агаризованной питательной среды в чашке Петри

пипеткой наносят каплю с суспензией с исследуемым фагом

66

2.Чашку поворачивают вертикально, чтобы капля могла стечь на противоположный конец и выдерживают в горизонтальном положении до полного впитывания суспензии фага.

3.На поверхность чашки перпендикулярно к впитавшейся суспензии фага производят засев стерильной бактериальной петлей культур различных штаммов исследуемых бактерий.

4.Чашки помещают в термостат на 18 - 20 часов при оптимальной для развития бактерий температуре (рисунок 36).

Чувствительность к бактериофагу проявляется в виде зон лизиса бактериальной культуры в местах контакта с бактериофагом или появлением

отдельных негативных колоний. Определяют индекс чувствительности испытанныхÏолесÃÓбактериальных культур к фагу.

одного вида, различающиеся по набору рецепторов для строго специфических бактериофагов, разделяют на фаготипы (фаговары). Наборы типовых бактериофагов применяют при массовых эпидемиологических исследованиях, позволяющих выявить источник инфекции и пути передачи возбудителя и его хозяина и установить связь между источниками инфекции

иотдельными случаями заболеваний. В медицинской практике

фаготипирование используется при стафилококковой, брюшнотифозной

67

инфекциях, паратифе В и др. Созданы коллекции фагов, специально предназначенные для типирования возбудителей заболеваний (например,

Staphylococcus aureus).

Техника фаготипирования бактерий

1. Исследуемую культуру бактерий E. Coli B засевают шпателем на поверхность 1,5% агаризованной питательной среды в чашки Петри для получения сплошного роста.

указывающих, что клетки данной культуры чувствительны к исследуемому фагу (рисунок 37)

.

Рисунок 37 – Техника постановки эксперимента по фаготипированию бактерий

68

Техника типирования стафилококков набором 23 эталонных фаговаров. 1. Суточную культуру золотистого стафилококка 209 Р высевают в 2,5 мл

бульона Хоттингера, выращивают в течение 3-4 ч.

2. Засевают газоном на свежеприготовленную и подсушенную чашку Петри с 1,2%-м агаром.

3. Дно засеянной чашки Петри делят карандашом на 23 квадрата.

4. В каждый из квадратов стандартной петлей или пастеровской пипеткой наносят каплю соответствующего фага.

5. После подсыхания капель фагов чашку Петри переворачивают крышкой вниз и инкубируют (37°С, 5-6 ч) или оставляют при комнатной

температуре на сутки.

последнихÏолесÃÓбудут видны отдельные негативные колонии фагов. Отмечают две изолированные колонии: крупную и мелкую, и с помощью

Результаты действия фага учитывают по степени лизиса культуры стафилококка, обозначая плюсами - от «±» до «++++».

3.4 Получение чистых линий бактериофагов

На практике при получении мутантов, генетиче ком анализе и т.п. часто

приходится выделять чистые линии бактериофагов, представляющие собой потомство одной фаговой частицы. Суще твуют приемы, позволяющие

Техника получения чистых иний фагов

Смесь Т-четных и Т-неч тных бакт риофагов, образующих крупные и

мелкие негативные ко онии, высевают на газон бактерий E. coli B.

1. В полужидкий 0,7 % расп ав енный агар вносят 0,2 мл культуры

бактерий, перемешивают и нас аивают в чашки Петри на поверхность 1,5 % питательного агара.

2. Чашки п дсушивают, затем полоски стерильной фильтровальной

бумаги обмакивают в смесь бактериофагов и проводят ими параллельные линии по газону бактериальной культуры (сверху вниз, до 10 линий на чашку).

3. Чашки помещают в термостат н (37 °С).

4. В местах нанесения фага будут видны зоны лизиса бактериальной

культуры, причем на первых полосах лизис будет более выражен, а на

бактериологической петли переносят каждую вместе с агаром в отдельную пробирку с 1 мл бульона.

негативные колонии одного типа, в противном случае процедуру расчистки повторяют.

Линия фага считается чистой, когда однородные негативные колонии фага образуются на протяжении не менее 5 пассажей.

Лизогения - это биологическое явление, сущность которого заключается в способности бактериальной культуры в бесчисленном ряду поколений нести в своем составе фаг в особой неинфекционной форме, называемой профагом.

В форме профага вирус не патогенен для клетки, сохраняя, однако, потенциальную способность стать вирулентным при переходе в зрелый (активныйÏоле) фаг. Профаг находитсясÃÓв клетке либо в интегрированном с бактериальной хромосомой состоянии (например, X, Р22), либо в виде цитоплазматической частицы, в частности, профаги Р1 и N15 локализуются в цитоплазме клетки хозяина, образуя самостоятельный репликон, подобно плазмидам бактерий.

Бактерии, в составе клеток которых есть профаг, называются лизогенными. Лизогенные бактерии могут лизировать я и высвобождать зрелый фаг (либо спонтанно, либо при воздей твии индуцирующими факторами: УФ-излучение, ионизирующее излуч ние, обработка некоторыми кислотами и перекисями и др.). Они также иммунны к гомологичному фагу.

Лизогенизация - это проц сс п р хода бактериальной клетки в лизогенное состояние, обус ов нный инфицированием умеренным фагом.

Поскольку, как отмечено выше, при лизогенизации геном бактериофага может находиться в авт н мн м от генома бактерии-хозяина состоянии, перенос фазмид в клетки E. coli также можно назвать лизогенизацией.

На основе ДНК бактери фагов сконструированы несколько типов молекулярных вект р в. Вект ры внедрения имеют в своем составе один сайт встраивания фрагмента чужеродной ДНК. Векторы замещения имеют два или более мест встраивания экзогенных фрагментов ДНК за счет замещения фрагментов векторной фаговой ДНК. Космиды - это плазмидные векторы, в которы встроен участок генома фага X (cos-сайт), обеспечивающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу in vitro. Созданы клонирующие векторы на основе геномов нитевидных фагов (М13, fd, f1).

Фазмиды - это молекулярные векторы, которые являются искусственными гибридами между фагом и плазмидой. В их составе обнаруживаются фрагменты ДНК бактериофага X, содержащие все гены, необходимые для литической инфекции, а также плазмидная ДНК. Гены репликации как фага, так и плазмиды в фазмидах сохранены. Перед инфекцией клеток бактерий фазмидные ДНК упаковываются in vitro в капсидные белки фага

70