Вирусология

2.Заражают культуру клеток взвесью вируса.

3.Спустя 30-60 мин после адсорбции вируса на клетках монослой покрывают 3%-м расплавленным агаром, содержащим лошадиную сыворотку, солевые добавки и как индикатор нейтральный красный.

4.Зараженную вирусом культуру клеток помещают в термостат. Результат: В контрольных флаконах при нормальном росте клеток по

причине выделения ими метаболитов происходит подкисление среды и монослой равномерно окрашивается индикатором в розовый цвет. В опытных флаконах монослой пестрит – розовые участки клеток, не пораженные вирусами, перемежаются мелкими беловатыми островками –

обесцвечиваются (рисунок 22).

бляшками различной конфигурации, специфическими для того или иного вируса. ЦПДÏолесÃÓвирусов имеет очаговый характер, погибшие клетки дегенерируют, теряют способность удерживать нейтральный красный и

Рисунок 22 – Бляшки вируса п иомие ита в культуре клеток почки обезьян

Идентификация вирус в по их цитопатическому и патогенному действию в классической PH требует длительного времени, немалых усилий и умения. Гораздо легче вид вую принадлежность вирусов установить в реакциях гемагглютинации (РГА) и торможения гемагглютинации (РТГА) или реакциях гемадсорбции (РГадс) и торможения гемадсорбции (РТГадс), представляющих собой реакции нейтрализации поверхностных вирусных антигенов.

2.4.2 Реакция гемагглютинации (РГА)

Большинство вирусов обладает способностью агглютинировать определенные эритроциты. Вирусы гриппа и эпидемического паротита агглютинируют эритроциты кур, морских свинок, человека; вирус клещевого энцефалита эритроциты барана; вирусы японского энцефалита – эритроциты однодневных цыплят и гусей; аденовирусы – эритроциты крыс, мышей, обезьян. РГА широко применяется в вирусологической практике для обнаружения гемагглютинируюших вирусов и их титрования. Реакция

41

проста по технике выполнения, дает быстрые и достаточно точные результаты. Наиболее часто применяют при диагностике гриппа и других острых респираторных вирусных инфекциях, для обнаружения ряда других вирусов, обладающих гемагглютинируюшими свойствами. В научных исследованиях РГА является удобной моделью для изучения механизма взаимодействия вируса и клетки (рисунки 23, 24).

ÏолесÃÓРисунок 23 – .Реакция гемагглютинации

Техника постановки РГА:

1. В лунках плексигласовых планш т готовят двукратно возрастающие разведения вируссодержащих жидко т й объ мом 0,5 мл, начиная с 1:10 и до

1:1280 (таблица 6).

2. В лунки с разведениями добав яют к ним по 0,25 мл 2%-й взвеси эритроцитов, трижды отмытых изотонич ским раствором натрия хлорида. Доску осторожно встряхивают.

3. Для к нтр я сп нтанной агглютинации 0,5 мл эритроцитов смешивают равным бъем м из тонического раствора натрия хлорида.

4. Смеси инкубируют в термостате (37°С) или в холодильнике (4°С), можно оставить при к мнатн й температуре 30-45 мин.

Таблица 6 – Схема постановки РГА при диагностике гриппа

Примечание: «+++» – гемагглютинация – положительная реакция, «-» - гемагглютинация отсутствует – отрицательная реакция. При гемагглютинации на «++» осадок имеет форму зонтика и занимает все дно лунки. При отсутствии агглютинации эритроциты оседают в центре лунки в виде компактного диска.

ÏолесÃÓРисунок 24 – Учет реакции гемагглютинации

Титр вируса – то наибольшее его разведение, при котором еще наблюдается выраженная гемагглютинация («+++» или «++»). В примере – титр вируса 1:320 (таблица 6). Количественное содержание виру а в разведении, равном титру, называется гемаглюшинирующей единицей ( одержится в 0,5 мл разведения 1:320). Определение этой в личины необходимо для постановки реакции торможения гемагглютинации, в которой в качестве рабочей дозы вируса берут 4 гемагтлютинирующие диницы.

Являясь группоспецифич ской, РГА не да т возможности определить видовую принадлежность вирусов, так как не является иммунологической реакцией здесь нет системы антиген - антитело.

2.4.3 Реакция непрям й (пассивной) гемагглютинации (РНГА или РПГА) ставится эритр цитарным антительным диагностикумом. Один из компонентов (антиген или антитело) адсорбирован на эритроцитах, которые при образовании к мплекса антиген - антитело склеиваются и выпадают в осадок. Данная серологическая реакция позволяет обнаруживать и идентифицировать неизвестный вирусный антиген, а также обнаруживать антитела и определять их титр в исследуемых сыворотках.

Техника постановки РНГА:

1. В лунки плексигласового планшета разливают 0,25-0,5 мл двухкратные разведения вируса.

2. Эритроциты обрабатывают раствором таннина в разведении 1:20 000- 1:200 000 в течение 15 мин, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность.

3. Смешивают их с диагностической сывороткой. 4. Инкубируют в термостате (37°с, 2 ч).

5. Сенсибилизированные антителами эритроциты 2-3 раза отмывают 0,85% раствором натрия хлорида.

43

6.Добавляют их в дозе 0,1-0,25 мл 0,5% в лунки к разведениям вируса.

7.Инкубируют в термостате 2 ч.

Результаты РНГА оценивают плюсами:

«++++» – эритроциты равномерно покрывают всю лунку пластинки в виде зонтика с неровными краями,

«+++» и «++» – осадок эритроцитов в виде зонтика, в центре небольшое кольцо из несклеившихся эритроцитов;

«+» в основном несклеившиеся эритроциты.

При отрицательной реакции эритроциты спонтанно агглютинируют в виде маленького диска («пуговицы») на дне лунок (рисунок 25).

ÏолесÃÓРисун к 25 – Реакция непрямой гемагглютинации:

ЭрАт – эритр цитарно-антите ьный диагностикум; Аг – вирусные антигены

2.4.4 Реакция т рм жения гемагглютинации (РТГА)

Если предварительно соединить вирус со специфической иммунной вируснейтрализующией сывороткой и уже потом добавить эритроциты, то такой инактивированный вирус теряет способность вызывать гемагглютинацию (рисунок 26). Вируснейтрализующая сыворотка оказывает тормозящее действие на реакцию гемагглютинации. и по отсутствию или наступлению РГА можно судить том, произошла ли реакция нейтрализации между вирусом и сывороткой. она обладает иммунологической специфичностью и может быть использована:

а) для окончательной идентификации неизвестного гемагглютинирующего вируса – по специфической диагностической сыворотке;

б) для выявления титра неизвестных антител в сыворотке больного – по известным вирусным антигенам-диагностикумам.

Ингибиторы. Затрудняет применение РТГА наличие в сыворотках крови

44

человека и животных неспецифических вирусных ингибиторов, которые могут вызвать неспецифическое торможение гемагглютинации. Чтобы избежать искажения результатов РТГА, выпускают противовирусные диагностические сыворотки, освобожденные от ингибиторов.

Техника постановки РТГА:

1. На плексиглас в й д ске г товят три ряда двукратных возрастающих разведений в из т ническ м растворе натрия хлорида (0,25 мл) диагностических пр тив грипп зных сывороток A(H1N1), A(H2N2) и A(H3N2) от 1:10 до 1:320 (до титра сывороток).

2. Во все лунки к кажд му разведению добавляют равные объемы вируссодержащей жидкости (при типировании вируса гриппа, например, в четырехкратном титре, т. . 4 гемагглютинирующие единицы (доза была оттитрована в РГА, таблица 6)).

3. Контролем является взвесь вируса в изотоническом растворе натрия хлорида.

ÏолесÃÓРисунок 26 – Р акция тормож ния г магглютинации

4. Планшеты со смесью сывороток и вируса выдерживают в термостате (30 мин.) или при комнатной температуре (1 ч).

5. В каждую лунку добавляют по 0,5 мл 1%-й взвеси эритроцитов кур. Учет результатов проводят через 30-40 минут.

В данном примере торможение гемагглютинации произошло с сывороткой A(H3N2), следовательно, выделен вирус гриппа, принадлежащий подтипу A(H3N2) (таблица 7).

45

Таблица 7 – Схема постановки РТГА для определения видовой принадлежности вируса гриппа А

ПримечаниеÏолесÃÓ: «+++» – гемагг ютинация – отрицательная реакция, «-» – торможение гемагг ютинации (нейтра изация) – положительная реакция

Титр вируснейтрализующей сыворотки – максимальное ее разведение, вызвавшей задержку агглютинации эритроцитов (в таблице титр составил 1:160)(таблица 7, рисунок 26).

Рисунок 26 – Титрование вируса гриппа в РТГА с куриными эритроцитами

46

2.4.5 Реакция гемадсорбции (РГадс)

Реакция гемадсорбции – способность культур клеток, зараженных некоторыми вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты, что связано с встраиванием в мембрану зараженных вирусом клеток вирусспецифических белков – гемагглютининов, к которым эритроциты имеют комплементарные рецепторы и поэтому адсорбируются на поверхности зараженных клеток. По характеру и механизму проявления РГадс является модификацией РГА. Применяют эритроциты морской свинки, кур, обезьян, человека 0(I) групп крови. Зараженные вирусом клетки приобретают способность к гемадсорбции задолго до возникновения в них

цнтопатических изменений, что позволяет использовать реакцию гемадсорбции для раннего обнаружения вирусов в зараженной культуре. Наиболее часто применяется для раннего обнаружения парагриппозных вирусов в носоглоточных смывах больных. Реакцию применяют также и для титрования вирусов и выявления специфических антител.

При микроскопииÏолесÃÓпод малым увеличением в опытной пробирке регистрируют положительную реакцию гемадсорбции – эритроциты адсорбируются на клетках культуры прилипая к клеточному слою – диффузно, либо локально в виде скоплений, гроздей и розеток (видоспецифично); в контрольной пробирке клеточный слой свободен от эритроцитов. Отрицательная – на монослое адсорбируются лишь единичные эритроциты (рисунок 27).

Техника постановки РГадс:

1. Клеточные культуры заражают и ледуемым материалом по описанной

выше методике.

2. РГадс ставят каждые два дня до появл ния положительной реакции (в

течение 8-10 дней).

3. В пробирку с зараженной культурой (иногда предварительно удалив

среду) вносят по 0,2 мл (0,4%-1%) взв си отмытых изотоническим раствором

натрия хлорида стери ьных эритроцитов, чувствительных к

гемагглютинирующему действию предпо агаемого вируса.

47

диагностической сывороткой, нейтрализующей РГадс вирусов. Вследствие специфичности этого явления, реакция может быть использована для идентификации выделенных вирусов, а также целью обнаружения и титрования вируснейтрализующих антител в ыворотках больных.

2.4.7 Реакции с мечеными антит лами

Меченые антитела – конъюгированные антитела с индифферентными для них веществами, которые, не изм няя их специфичности, придают иммуноглобулинам характерные свойства, что облегчает идентификацию вирусов в иммунных комп ексах.

Реакциях с мечеными антите ами чаще используются «метки»:

1) в реакциях иммун ф юоресценции (РИФ) – флюорохромы, в

частности флю ресцеиниз ти цианат (ФИТЦ)

2) для иммун ферментн го анализа (ИФА) – ферменты (чаще пероксидаза);

3) для радиоиммунного анализа (РИА) – радиоактивные изотопы (125I); 4) в иммуноэлектронной микроскопии вирусов (ИЭМ) –

железосодержащий белок ферритин (рисунок 28).

По сравнению PH, РТГА и РТГадс реакции с мечеными антителами отличаются более высокой чувствительностью и позволяют идентифицировать вирусы даже в материалах. Широко используются в экспресс-диагностике вирусных инфекций.

48

РисунокÏолес28 – Серологические реакции сÃÓиспользованием меченых антител:

Аг - вирусный антиген; Ig – иммуноглобулин

2.4.7.1 Реакция иммунофлюоресценции (РИФ), или метод флуоресцирующих антител (МФА) (метод Кунса) основана на взаимодействии антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфическими антителами, химиче ки конъюгированными с флюоресцирующими красителями (флуоре цеинизотиоцианат — ФИТЦ, родамин, В-изотицианит, лиссатииродамин В-200, сульфохлорид), имеющими реакционно-способные группы ( ульфохлорид, изотиоцианит). Иммунофлуоресцентно окраш нные компл к ы антиген-антитело становятся хорошо видимыми, ярко св тящимися структурами под люминесцентным микроскопом или конфока ьной микроскопи й. Широко применяется для быстрой расшифровки этио огии острых респираторных вирусных инфекций при анализе мазк в- тпечатк в со изистой оболочки верхних дыхательных путей. Разраб таны два варианта постановки РИФ - прямая и непрямая реакции.

При прям м мет де (пМФА)– применяются меченные красителем антитела к вирусам, к т рые наносятся на инфицированные клетки (мазок, культура клеток). Таким образом, реакция протекает одноэтапно. Неудобством метода является необходимость иметь большой набор конъюгированных специфических сывороток ко многим вирусам.

При непрямом методе (нМФА) , как например, для определения антител класса М и G к вирусам Западного Нила (ЗН) и Тягиня в сыворотке крови и ликворе больных людей. Антиген, содержащийся в фиксированных клетках перевиваемой культуры BGM, зараженной вирусами. Антитела класса М и G обнаруживают в ликворе и сыворотке крови больных за счет свойств антигена специфически связываться с гомологичными антителами. Выявление связавшихся с антигенами антител проводится с помощью антивидовой сыворотки, меченной флуоресцеинизотиоционатом (иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих) и содержащей антитела к иммуноглобулинам М и G (IgM и G) человека. Учет реакции

49

проводят с помощью люминесцентного микроскопа. (рисунок 29).

1.На ÏолесÃÓобезжиренн м предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки, а из рган в и тканей - мазки-отпечатки.

2.Препараты п дсушивают, фиксируют.

3.При прям м варианте РИФ наносят на них меченую сыворотку, взятую в рабочем разведении.

4.Помещают во влажную камеру (37°С, 20-30 мин. или 18-21°С, 25-40

мин.).

5.При непрямом, более чувствительном варианте реакции люминесцирующая антисыворотка на такое же время прибавляется вслед за немеченой.

6.Избыток флюоресцирующих антител из препаратов удаляется промыванием в забуференном изотоническом растворе хлорида натрия в течение 10—15 мин с последующим ополаскиванием в дистиллированной или проточной воде в течение 10 мин.

50