Разложение спектра поглощения смеси на составляющие.

При спектральных исследованиях часто возникает необходимость разложить спектральную кривую поглощения, представляющую собой сумму спектров поглощения двух или более компонентов, на составляющие.

В качестве примера рассмотрим смесь, состоящую из двух веществ А и В. Для того, чтобы разложить спектр поглощения этой смеси на отдельные составляющие, необходимо измерить три спектра поглощения: спектр исследуемой смеси и спектры стандартных растворов (растворов с известной концентрацией) каждого вещества в отдельности.

Отношение оптической плотности данного компонента в смеси к его оптической плотности в стандартном растворе при любой длине волны есть величина постоянная. Для веществ А и В

D_A^1 D_A^2 D_A^i

К_A = = =

D_Aст^1 D_Aст^2 D_Acт^i

D_B^1 D_B^2 D_B^i

К_B = = =

D_Bст^1 D_Bст^2 D_Bcт^i

Из приведенных выше уравнений видно, что спектр поглощения вещества А в смеси можно получить, перемножив при всех длинах волн оптическую плотность вещества А в стандартном растворе на коэффициент К_A . Точно так же можно найти спектр поглощения вещества В в смеси. Задача сводится к определению этих коэффициентов.

Вследствие аддитивности оптических плотностей для смеси веществ А и В

D^1 = D_A^1 + D_B^1 = К_A D_Aст^1 + К_B D_Bст^1

D^2 = D_A^2 + D_B^2 = К_A D_Aст^2 + К_B D_Bст^2

Решение этой системы уравнений дает следующие выражения для коэффициентов А и В:

D^1 D_Bст^2 - D^2 D_Bст^1

K_A =

D_Aст^1 D_Bст^2 - D_Aст^2 D_Bст^1

D^2 D_Aст^1 - D^1 D_Aст^2

K_B =

D_Aст^1 D_Bст^2 - D_Aст^2 D_Bст^1

При сложении полученных спектров поглощения веществ А и В в смеси (т. е. при сложении оптических плотностей при каждой длине волны) должна получиться кривая, совпадающая с измеренным спектром поглощения смеси. Расхождение между этими кривыми будет указывать на то, что в смеси присутствует более чем два поглощающих компонента, либо говорить о наличии взаимодействия между компонентами, составляющими смесь.

З А Д А Н И Е

1). Получить у преподавателя следующие образцы для исследования: стандартные растворы двух веществ (назовем их условно А и В); раствор, представляющий собой смесь веществ, и дистиллированную воду в качестве контрольного образца.

2). Ознакомиться с порядком работы на спектрофотометре (с помощью преподавателя).

При проведении спектральных измерений необходимо помнить следующие важные правила:

а) Начинать измерения следует при минимальной ширине щели 0.15 нм во избежание засвечивания фотоэлементов спектрофотометра.

б) Открывать крышку кюветного отделения можно только при установленной в положение ЗАКР рукоятке переключения шторки.

Снимать показания следует при плотно закрытой крышке кюветного отделения.

в) Перемещать кюветодержатель необходимо осторожно, без рывков, чтобы кюветы сохраняли свое положение на протяжении всего периода измерений.

г) Растворы для исследования должны быть прозрачными, без пузырьков воздуха, способствующих увеличению рассеяния света. Нельзя исследовать холодные растворы, так как на стенках кювет могут конденсироваться пары воды (кюветы запотевают). Кюветы нужно заполнять до такого уровня, чтобы измеряющий световой пучок целиком проходил через слой раствора.

д) Кюветы должны быть чистыми, а их внешние стенки - сухими. Нельзя касаться руками оптических стенок кювет. Капли, царапины и грязь на их поверхности рассеивают, отражают и поглощают свет, что приводит к искажению результатов. Кюветы очень хрупкие, поэтому с ними надо обращаться осторожно, не допускать механических повреждений.

3). Убедиться в чистоте кювет, при необходимости вымыть их.

4). Последовательно измерить спектры поглощения стандартных растворов и смеси в диапазоне длин волн 400 - 560 нм через каждые 5 нм. В области максимумов поглощения измерения проводить с шагом 2 нм. В качестве контрольного образца берется дист. вода.

5). На рисунке 1 построить спектры поглощения стандартных растворов веществ. На рисунке 2 построить измеренный спектр поглощения смеси.

6). Выбрать две длины волны ₁ и ₂ так, чтобы при ₁ поглощало в основном первое вещество, а при ₂ - второе. Отметить выбранные длины волн на рис. 1.

7). Рассчитать  при ₁ и ₂ для каждого из веществ. Концентрации веществ в стандартных растворах указаны на пробирках.

8). Заполнить таблицу

	1, нм	2, нм
A , М-1см-1
В , М-1см-1
D смеси

9). Пользуясь таблицей и формулами, приведенными выше, рассчитать концентрации каждого из веществ в смеси.

10). Исходя из полученных спектров поглощения, рассчитать коэффициенты К_А и К_В.

11). Построить спектры поглощения веществ А и В в смеси на рисунке 2.

12). Сложив полученные спектры поглощения веществ А и В в смеси, построить суммарный спектр на рисунке 2 и сравнить его с измеренным спектром поглощения смеси. Сделать вывод о наличии или отсутствии примесей в данной для исследования смеси.

13). На двух подготовленных рисунках сделать все необходимые обозначения и подписи.

14). Сформулировать и записать выводы в рабочей тетради.

З А Д А Ч И К Р А З Д Е Л У

С П Е К Т Р О Ф О Т О М Е Т Р И Я

1. Раствор исследуемого пигмента поглощает 90% падающего света. Во сколько раз увеличится коэффициент поглощения раствора при двукратном увеличении концентрации пигмента ? Допустить, что закон Бугера-Ламберта-Бера соблюдается.

2. Раствор вещества А в кювете толщиной 1 см пропускает 90% света. Раствор вещества Б в той же кювете пропускает 80% света. Какова оптическая плотность смеси равных объемов этих растворов, измеренная в кювете толщиной 1 см ?

3. Максимум поглощения гема гемоглобина наблюдается при =418 нм. Рассчитать поперечное сечение гема гемоглобина, если оптическая плотность раствора гемоглобина с концентрацией 0,5 мг/мл при =418 нм и l=1 cм равна 0,88. М.в. гемоглобина 68000. Одна молекула гемоглобина содержит 4 гема.

4. Оптическая плотность раствора сывороточного альбумина при =255 нм составляет 1,5. Молекула человеческого сывороточного альбумина содержит 2 остатка триптофана и 18 остатков тирозина. ₂₅₅ триптофана = 2800 М^-1см^-1, ₂₅₅ тирозина = 300 М^-1см^-1. Рассчитать молярные концентрации триптофана и тирозина в растворе этого белка и молярную концентрацию самого белка.

5. Рассчитать концентрацию белка, если одна его молекула содержит 2 остатка триптофана (₂₈₀=5000 М^-1см^-1) и 4 остатка тирозина (₂₈₀=1500 М^-1см^-1), оптическая плотность раствора белка D₂₈₀=0,5 при толщине кювет 1 см.

6. Оптическая плотность раствора белка концентрации 2,7^.10^-5 М, содержащего 2 остатка триптофана и несколько остатков тирозина в молекуле, равна 1,0 при =280 нм. Сколько остатков тирозина в молекуле белка, если _тир=1500 М^-1см^-1, _три=5000 М^-1см^-1 (=280 нм), толщина кюветы 1 см ?

7. Раствор НАД имел оптическую плотность 0,05 при =340 нм (толщина кюветы 1 см). После частичного восстановления НАД до НАДН плотность раствора возросла до 0,2. Какова стала концентрация НАД и НАДН в растворе, если их молярные коэффициенты экстинкции равны 10³ М^-1см^-1 и 6^.10³ М^-1см^-1 соответственно?

8. Определить молярную концентрацию белка, содержащего 2 остатка триптофана в молекуле, если в кювете толщиной 1 см оптическая плотность раствора белка равна 1, вклад светорассеяния в эту величину составляет 20%, коэффициент молярной экстинкции триптофана равен 5000 М^-1см^-1 (=280 нм).

9. В растворе пигмента 30% молекул образуют димеры. Молярный коэффициент экстинкции димера в 1,6 раза больше, чем у мономера. Будет ли наблюдаться отклонение от закона Бугера-Ламберта-Бера ?

10. Раствор соединения А имеет D₂₆₀=0,45 и D₄₅₀= 0,03. Раствор второго соединения Б имеет D₂₆₀=0,004 и D₄₅₀=0,81. 2 мл раствора А смешали с 1 мл раствора Б. Результирующая оптическая плотность смеси D₂₆₀= 0,3 и D₄₅₀=0,46. Имеется ли взаимодействие между А и Б ? Объяснить. Какое допущение делается, чтобы подтвердить это заключение?

11. Молярный коэффициент поглощения данного соединения при =482 нм равен 348 М^-1см^-1. Раствор этого соединения имеет D₄₈₂= 1,6. При разбавлении 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 и 1:6 величина D₄₈₂ составляет 1,52; 1,41; 1,05; 0,84; 0,70 и 0,61 соответственно. Какова молярность исходного раствора ?

12. 0,1 мл раствора аденозина в фосфатном буфере разбавили до объема 25 мл. Оптическая плотность полученного раствора при 259 нм оказалась равной 0,77. Молярная экстинкция аденозина при 259 нм составляет 1,54^.10⁴ М^-1см^-1 . Какова концентрация исходного раствора аденозина ?

6