2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)

Рисунок 11 - Вскрытие куриных эмбрионов.

Нередко при вскрытии эмбриона не удается обнаружить ни одного признака размножения вируса, хотя он и находится в исследуемом материале. Такой пас-

саж, как уже говорилось, называется «слепым».

Вскрытие эмбриона и получение вируссодержащего материала (рисунок 11).

Вскрывают эмбрионы с целью обнаружения признаков размножения в них виру-

сов и получения вируссодержащего материала.

Перед вскрытием скорлупу обрабатывают йодированным спиртом (иногда еще фламбируют). Вскрытие производят в боксе, пользуясь стерильными инстру-

ментами и посудой. Скорлупу срезают над той воздушной камерой (естественной или искусственной), через которую заражали. При этом яйцо держат под неко-

51

торым углом, чтобы скорлупа не упала внутрь. Ножницы не должны касаться и повреждать лежащую под воздушной камерой оболочку, для этого срез должен проходить несколько выше границы воздушной камеры.

Обнажившуюся ХАО осматривают, приподнимая ее пинцетом с целью уста-

новления в ней патологоанатомических изменений. Часть ХАО, на которую был нанесен вируссодержащий материал, имеет обычно наиболее выраженные изме-

нения. Для более тщательного осмотра ее и взятия этой части приподнимают пинцетом ХАО в этом месте и срезают ножницами возможно больше. Для осмот-

ра и взятия всей ХАО удаляют зародыш, желточный мешок и белок, а ХАО от-

слаивают от внутренней поверхности скорлупы, извлекают и переносят в сте-

рильную чашку Петри с физраствором. Оболочку отполаскивают, а затем двумя пинцетами расправляют так, чтобы она лежала в один слой и могла быть осмот-

рена по всей поверхности. Для того чтобы патологоанатомические изменения оболочки были видны более отчетливо, под чашку Петри подкладывают лист черной бумаги.

Аллантоисную жидкость в количестве до 10 мл отсасывают пипеткой, кото-

рой прокалывают подскорлупную оболочку и ХАО над телом зародыша. Такое направление пипетки предотвращает случайный разрыв стенки желточного меш-

ка и смешивание его содержимого с набираемой аллантоисной жидкостью.

Амниотической жидкости удается отсосать до 1 мл. Для этого после удале-

ния аллантоисной жидкости пипетку вводят в амнион между головой и телом за-

родыша под его шеей.

Для получения стенки желточного мешка как вируссодержащего материала желток извлекают на чашку Петри, стенку его разрезают ножницами и отполаски-

вают от содержимого в физрастворе. Тело зародыша извлекают, удерживая его за шею.

Перечень контрольных вопросов:

1.Цели использования куриных эмбрионов в вирусологии.

2.Преимущества куриных эмбрионов перед лабораторными животными.

3.Взаимосвязь между возрастом куриного эмбриона и методом заражения.

52

4.Овоскопирование.

5.Заражение эмбрионов в аллантоисную полость.

6.Заражение эмбрионов на хориоаллантоисную оболочку.

7.Заражение эмбрионов в желточный мешок.

8.Заражение эмбрионов в амниотическую полость.

9.Заражение эмбрионов в тело зародыша.

10.Заражение эмбрионов в кровеносные сосуды.

11.Выявление вируса из эмбриона при помощи реакции гемагглютинации.

Тема 1.5. Культуры клеток, их получение и использование в вирусологиче-

ской практике

Цель: изучить способы применения культур клеток в вирусологической прак-

тике.

Содержание:

виды культур клеток;

хранение культур клеток;

контаминация культур клеток;

растворы;

питательные среды;

посуда;

требования к культурам клеток;

подбор культур клеток;

заражение культур клеток;

культивирование культур клеток;

цитопатическое действие вируса на клетки;

реакция гемадсорбции;

метод бляшкообразования;

цветная проба;

обнаружение внутриклеточных телец включений;

интерференция;

53

получение первично-трипсинизированных культур клеток из кожно-

мышечной ткани развивающихся куриных эмбрионов.

Культура клеток - это клетки многоклеточного организма, живущие и раз-

множающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro) (рисунок 12).

Виды культур клеток

Первично-трипсинизированные культуры клеток - клетки, полученные непо-

средственно из органов или тканей организма,

растущие in vitro в один слой. КК можно по-

лучить из любого органа или ткани человека или животного.

Для получения первичных клеток от здо-

рового животного не позднее 2-3 ч после убоя берут соответствующие органы или ткани, из-

мельчают их на кусочки (1-4 мм) и обрабаты-

вают ферментами (трипсином), разрушающи-

ми межклеточные вещества. Полученные при этом отдельные клетки суспендируют в пита-

тельной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термо-

стате при 37 °С. Клетки прикрепляются к

стеклу и начинают делиться. Размножаясь, Рисунок 12 - Культуры клеток. клетки размещаются на поверхности стекла и при его полном покрытии в один

слой контактируют друг с другом и прекращают делиться. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку - монослой.

Обычно монослой формируется через 3-5 дней. Скорость его формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факторов. Питательную среду меняют по мере за-

грязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизне-

способность в течение 7-21 дня (в зависимости от вида клеток и состава пита-

54

тельной среды). Интенсивность размножения клеток и состояние монослоя конт-

ролируют визуально под малым увеличением микроскопа (объектив х10).

Для культивирования вирусов используют молодые культуры клеток (как только сформировался монослой).

Субкультуры. Получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, пу-

тем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, растущая в новой пита-

тельной среде и пересева на новые матрасы или пробирки. Через 2-3 суток фор-

мируется монослой.

Субкультуры получают от 2-5 пассажей (перевивок) и очень редко до 8-10.

Последующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели.

Если клеточные культуры прошли более 10 пассажей, они уже на стадии перехода к перевиваемым культурам клеток.

Перевиваемые культуры клеток - это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды).

Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культи-

вирования.

Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных клеток он диплоидный), стабильны в условиях рос-

та in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью (ограничивает использование перевиваемых культур клеток для культивирования вирусов при производстве вакцин).

Диплоидные культуры клеток Это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограни-

ченный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами роста, сохраняющая в про-

цессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от кон-

таминантов и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации хо-

мячкам.

55

Диплоидные клетки получены из различных тканей эмбриона человека и жи-

вотных. Диплоидные клетки в отличие от перевиваемых имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50±10, затем количе-

ство делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Однако диплоидные клетки могут быть использованы в течение длительного времени, т.к. при каждом пассаже часть клеток можно заморозить (минус 196 °С) и при необходимости вос-

становить.

Диплоидные клетки имеют преимущества перед перевиваемыми и первич-

ными клетками: 10-12 дней они могут быть в жизнеспособном состоянии без сме-

ны питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспо-

собны в течение 4 недель; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам.

Суспензионные культуры клеток. Выращивание вирусов в суспензионных культурах клеток помогло в промышленном производстве вакцин и диагностику-

мов. Но только перевиваемые клетки хорошо культивируются в суспензии.

На микроносителях культивируемые клетки формируют монослой. Этот спо-

соб позволяет методами суспензионного культивирования выращивать зависимые от прикрепления к твердому субстрату клетки: первичные, субкультуры, дипло-

идные. Эти клетки принято называть поверхностно зависимыми.

Хранение культур. Наиболее простой метод консервирования культур - хра-

нение их при 4 °С до 1-6 недель. Успешно применяют хранение клеточных штам-

мов в условиях сухого льда (минус 78 °С) и жидкого азота (минус 196 °С). Клетки снимают с матрасов, суспендируют в концентрации 106 в 1 мл питательной среды,

содержащей в качестве защитных веществ 10-40 % сыворотки и 10 % очищенного стерильного глицерина. Затем клеточную суспензию разливают в ампулы, запаи-

вают и выдерживают 1-3 ч при 4 °С, после чего замораживают клетки в смеси этилового спирта с сухим льдом. Скорость охлаждения не должна превышать 1 °С

в 1 мин. При снижении температуры до минус 25 °С ампулы помещают для хра-

нения в сухой лед. Если для хранения используют жидкий азот, то ампулы с клет-

ками охлаждают до минус 70 °С и кладут в жидкий азот. Хранение клеток в жид-

56

ком азоте в течение ряда лет не изменяет их активность и чувствительность к ви-

русам.

Восстанавливают замороженные клетки: ампулу с замороженными клетка-

ми быстро погружают в водяную баню на 1-2 мин при легком встряхивании, за-

тем клетки выливают в матрас, добавляют соответствующее количество ростовой среды и культивируют в термостате при 37 °С. Для удаления глицерина питатель-

ную среду заменяют на следующий день после посева.

При транспортировке клеток матрасы с выросшим монослоем заливают средой доверху и закрывают резиновой пробкой. В лаборатории питательную среду сливают и используют при культивировании этих клеток в виде добавок к питательной среде, применяемой в данной лаборатории.

Можно транспортировать и клеточную суспензию при 4 °С. При благоприят-

ных условиях транспортировки, исключающих перегревание и замораживание клеток, 80-90 % из них сохраняют жизнеспособность до 7-8 дней.

Контаминация культур. Работа с культурами клеток требует постоянного контроля на отсутствие посторонних агентов (контаминантов) - вирусы, бактерии,

грибы, микоплазмы и клетки других культур. Микоплазмы - одни из наиболее частых контаминантов, особенно в перевиваемых линиях клеток. Резкое закисле-

ние питательной среды в культуральных флаконах и опалесценция ее могут быть следствием контаминации культур микоплазмами. Необходим тест-контроль на отсутствие микоплазмоконтаминации (посев на питательные среды, тест-

культуры, электронно-микроскопические).

В случае контаминации культуры клеток уничтожают, а культивирование во-

зобновляют из резервных расплодок, хранящихся в жидком азоте. Только редкие и уникальные культуры подлежат деконтаминации.

Предупредить размножение и подавить попавшие в культуры клеток бакте-

рии удается с помощью противомикробных препаратов (антибиотиков), добав-

ляемых в ростовые среды непосредственно перед их использованием. Эти пре-

параты следует строго дозировать. Выбор эффективного препарата или комплекса препаратов зависит от чувствительности к ним конкретных контаминантов. Их

57

использование - необходимое условие при возрастании риска контаминации в процессе получения первичных культур при крупномасштабном суспензионном выращивании клеток, массовом производственном культивировании перевивае-

мых клеток, а также во всех случаях объединения клеточного материала.

Растворы. Наиболее широко используют при работе с культурами растворы Хенкса и Эрла, которые готовят на бидистиллиро-

ванной воде с добавлением различных солей и глю-

козы (рисунок 13).

Растворы Хенкса и Эрла – это сбалансирован-

ные солевые растворы, которые используют для приготовления питательных сред, т.к. они обеспечи-

вают сохранение рН, осмотическое давление и соот-

ветствующую концентрацию необходимых неорга-

нических веществ. Их применяют при различных манипуляциях с культурами (отмывание от росто-

вых сред, разведение вируса и т. д.).

При культивировании клеток применяют дис-

пергирующие растворы трипсина и версена. Раствор трипсина (0,25 %-ный на фосфатном буфере) ис-

пользуют для разделения кусочков тканей на отдельные клетки и для снятия слоя клеток со стекла. Рисунок 13 - Раствор Хенкса.

Раствор версена - натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (0,02 %-

ный на растворе Хенкса) - используют для снятия клеток со стекла. Все растворы стерилизуют при соответствующих режимах.

Питательные среды различают:

Естественные среды состоят из смеси солевого раствора (Хенкса, Эрла), сы-

воротки крови (животных или человека), тканевого (эмбрионального) экстракта

(эмбрионов кур, коров, человека), коровьей амниотической жидкости и т. д. Ко-

личество каждого компонента в разных примесях сред значительно варьирует.

Используют эти среды редко.

58

В настоящее время применяют в основном искусственные питательные сре-

ды. К ним относят ферментативные гидролизаты различных белковых продуктов:

гидролизат лактальбумина, мышечный ферментативный гидролизат, фермента-

тивноказеиновый дрожжевой гидролизат, гемогидролизат, аминопептид и др.

Наиболее широко в вирусологии используют 5 % гидролизат лактальбумина, 5 %

и 2,5 % гемогидролизат.

Из синтетических сред наиболее широкое применение нашли среда 199 (ри-

сунок 14) и среда Игла (рисунок 15). В состав среды 199 входит более 60 компо-

(0,002 %) для определения концентрации водородных ионов (рН). В принятой концентрации он не оказывает токсического воздействия на клетки и вирусы. При снижении рН среда желтеет, что позволяет определять момент ее закисления про-

дуктами метаболизма клеток до уровня, требующего замены среды на свежую;

при сдвигах рН в щелочную сторону растворы принимают красно-малиновый

59

цвет. При нейтральном значении рН (7,2 - 7,4) цвет среды оранжево-красный. Для регулирования рН солевых растворов и питательных сред используют 7,5 % би-

карбонат натрия (NaHC03) и 3 % уксусная кислота (СН3СООН).

Для уничтожения микрофлоры перед использованием в среды добавляют ан-

тибиотики: пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл. Для подавления плесени используют натриевую соль нистатина по 100 мкг на 1 мл среды.

Все питательные среды принято делить на две группы:

ростовые - обеспечивают жизнь и размножение клеток. Содержат 2-10

%сыворотки крови, применяются в первые дни культивирования клеток;

поддерживающие – обеспечивают жизнедеятельность клеток, но не их размножение. Они не содержат сыворотки крови, используются после заражения КК вирусами.

Сыворотка крови крупного рогатого скота - обязательный компонент рос-

товых питательных сред. В ее состав входит ряд БАВ, необходимых для роста клеток in vitro. Содержащиеся в сыворотке активная фракция альбуминов и фету-

ин способствуют прикреплению клеток к поверхности стекла. Сыворотка пред-

ставляет собой чрезвычайно сложную смесь мелких и крупных молекул, способ-

ных как вызывать, так и тормозить рост клеток. К главным функциям сыворотки относятся: обеспечение гормональными факторами, стимулирующими рост кле-

ток и их функции; обеспечение факторами прикрепления и распластывания кле-

ток; обеспечение транспортными белками, переносящими гормоны, минеральные вещества, липиды и т.д. Белки сыворотки, прямо и специфически участвующие в стимуляции клеточного деления, называются факторы роста. Применяют сыво-

ротки коров или сыворотки телят. Самая лучшая сыворотка для культур клеток -

сыворотка эмбрионов коров. При получении сыворотки следует соблюдать стро-

гую стерильность. Каждая серия сыворотки проходит контроль на стерильность и токсические свойства по отношению к культурам.

Посуда. Должна быть стерильной, обезжиренной, не обладать токсическим действием. Для культивирования клеток используют пробирки, матрасы на 50, 100, 250, 500, 1000 и 1500 мл, роллерные колбы на 500, 1000, 2000 мл, различные

60