2018 ВИР и БИОТ ВЕТ л.з. (методичка)

Везикулярную жидкость можно собрать шприцам или пастеровской пипет-

кой в стерильную пробирку.

Стенки афт, корочки с поверхности кожи снимают пинцетом.

Спинномозговую жидкость используют редко. Ее берут асептично путем обычной пункции.

В экспериментах материал берут у животных, убитых в состоянии агонии.

Пробы берут в стерильных условиях. Следует избегать загрязнения проб со-

держимым пищеварительного тракта - в нем могут находиться непатогенные си-

ротские вирусы, вызывающие деструкцию КК, осложняя диагностические иссле-

дования.

Посмертно в качестве патматериала берут кусочки органов размером в не-

сколько см и массой 10-20 г, которые имеют видимые отклонения от нормы (по форме, размеру, цвету, консистенции, наличию необычных образований) и могут быть поражены и содержать вирус на основании клинической картины болезни перед смертью. Наиболее часто содержат вирус печень, селезенка, легкие, голов-

ной мозг, лимфатические узлы, почки. При подозрении на бешенство отправляют всю голову, слюну, маленький труп целиком.

Упаковка, транспортировка, хранение и консервирование вируссодержащего материала

Транспортировка и хранение проб. Для сохранения вируса пробирки (фла-

кончики) с патологическим материалом, закрытые резиновыми пробками, надо поместить в термос с охлаждающей смесью, состоящей их равных частей сухого льда (твердой углекислоты) и этилового спирта (температура -71 °С держится не-

сколько дней). Можно использовать смесь, состоящую из трех массовых частей льда или снега и одной массовой части поваренной соли. В последнем случае уда-

ется получить температуру -15-20 °С. Вместо замораживания можно использовать для консервирования химические средства (менее эффективно). Лучшим из по-

следних считается смесь равных объемов стерильных глицерина и 0,85%-ного раствора поваренной соли (изотонический раствор), в которую и помещается пат-

материал. Обычно эту смесь используют для консервирования кусочков паренхи-

21

матозных органов и тканей. Растворы глицерина менее пригодны для вируссо-

держащих жидкостей, особенно в тех случаях, когда этот материал нужно вводить животным, эмбрионам и в КК в не разведенном виде. Употребление глицерина делает невозможным исследование патматериала методом иммунофлюоресцен-

ции. Поэтому одновременно с пробой патматериала необходимо направлять маз-

ки-отпечатки, приготовленные и фиксированные на предметном стекле, для ис-

следования в люминесцентном микроскопе. Также можно консервировать вирусы при помощи антибиотиков.

Патматериал должен быть снабжен четкой этикеткой. На пробирке этикетка из лейкопластыря, на которой написано простым (графитным) карандашом, какой материал и от какого животного получен. На термос с пробами патматериала на-

вешивают бирку из картона или фанеры, на которой указывают хозяйство, вид животного, вид материала и дату. Термос должен быть опечатан. Взятый матери-

ал с сопроводительным документом, содержащим полную информацию о живот-

ном, от которого взяты пробы, эпизоотологические данные хозяйства, предполо-

жительный диагноз и меры, принятые для ликвидации болезни (лечение, вакци-

нации и т.д.), а также дату и фамилию врача, направляют с нарочным. Доставлен-

ные в лабораторию пробы рекомендуется немедленно использовать для выделе-

ния вируса. Если по каким-то причинам (отсутствие лабораторных животных, КЭ,

КК) исследование откладывается, материал необходимо хранить при температуре

-40 - -70 °С. Часть материала следует отдать для бактериологического и миколо-

гического исследований.

Упаковка: первичная емкость: емкость, содержащая пробу, пробирка с за-

винчивающейся пробкой с нетоксичной резиновой прокладкой, обернутой лейко-

пластырем, или запаянная стеклянная ампула; внутренняя упаковка: погло-

щающий материал - папиросная бумага или вата в количестве, достаточном для впитывания жидкости в случае утечки; пластиковый мешок, заполненный или за-

клеенный лейкопластырем (неволокнистым); наружная упаковка: противоудар-

ная прокладка -скомканная бумага или вата; твердый водонепроницаемый кон-

22

тейнер; плотно пригнанная крышка, завинчиваемая или утепляемая, заклеиваемая

лейкопластырем или закрепляемая специальными зажимами.

2. Подготовка вируссодержащего материала для исследования.

В лаборатории полученный патматериал освобождают от консерванта, от-

таивают, отмывают от глицерина, взвешивают. Часть материала берут для виру-

сологических исследований, а часть хранят в холодильнике на случай дополни-

тельных исследований.

Подготовка органов и тканей. Вирус необходимо высвободить из клеток органов и тканей и перевести в фосфатный буфер или раствор Хенкса. Для этого материал тщательно измельчают ножницами и растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Из растертого материала готовят 10 %-ную суспензию на фосфатном буфере или растворе Хенкса. Полученную суспензию центрифугиру-

ют при 1500-3000 минˉ1, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные фла-

коны и освобождают от микрофлоры, либо пропуская через бакфильтры (это де-

лают редко, т.к. теряется много вируса за счет адсорбции на фильтре), либо обра-

батывая антибиотиками широкого спектра действия (пенициллин, стрептомицин,

тетрациклин, и т.д.). Дозы антибиотиков: от 100 до 1-2 тыс. ЕД и более на 1 мл в зависимости от характера исследуемого материала. Следует избегать излишне больших доз антибиотиков, т.к. их избыток при дальнейшем внесении в КК может вызвать неспецифическую дегенерацию. Экспозиция суспензии с антибиотиками не менее 30-60 мин при комнатной температуре, затем материал подвергают бак-

териологическому контролю на наличие бактерий, грибов путем посева на МПА,

МПБ, МППБ и среду Сабуро. После получения отрицательного результата бакте-

риологического контроля вируссодержащий материал используют для заражения лабораторных животных, КЭ или КК. В случае положительного бактериологиче-

ского контроля суспензию вируса подвергают дополнительной обработке анти-

биотиками и повторно ставят контроль. Суспензию хранят при -20- -70 С.

Подготовка выделений из носа, глаз. Тампоны, погруженные в соответст-

вующий раствор, встряхивают 10-15 мин, отжимают, жидкость центрифугируют

20 мин при 2-3 тыс. минˉ1. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную

23

пробирку и в нее добавляют пенициллин и стрептомицин по 500-1000 ЕД на 1 мл,

выдерживают и после бактериологического контроля используют для заражения.

Подготовка фекалий. Пробу кала (приблизительно 1 г) помещают в баночку с бусами, содержащую 10 мл раствора Хенкса или фосфатно-буферного раствора.

После гомогенизации материала встряхиванием и последующего центрифугиро-

вания при 2-3 тыс. минˉ1 в течение 30 мин, надосадочную жидкость отсасывают,

добавляют пенициллин, стрептомицин по 500-1000 ЕД/мл. После 30-60-

минутного контакта производят посев на стерильность, замораживают и хранят при -10- - 20°С. В день заражения исследуемый материал оттаивают и повторно центрифугируют для удаления вновь образующегося после замораживания осад-

ка. Неиспользованный материал хранят в замороженном состоянии до конца ис-

следования. Исследование кала может быть заменено ректальными мазками, об-

работка которых требует меньше времени, а частота выделения вируса при этом не только не меньше, но иногда выше, чем при исследовании кала.

Мочу обрабатывают антибиотиками (500-1000 ЕД/мл) и используют для за-

ражения.

Содержимое папул, пузырьков и пустул, чешуйки и корки исследуют при кожных высыпаниях. Содержимое папул и пузырьков разводят физраствором 1:5,

а корки, чешуйки после растирания суспендируют в солевом растворе 1:5-1:10 и

центрифугируют при 2-3 тыс. минˉ1 в течение 10-15 мин. После обработки пени-

циллином и стрептомицином (по 200-500 ЕД/мл) материал используют для зара-

жения.

Подготовка крови. Используют либо цельную дефибринированную, либо

«лаковую» кровь, либо кровь с антикоагулянтом (5 мл крови + 5-6 капель гепари-

на и замораживают). После оттаивания гемолизированную кровь центрифугируют при 2-3 тыс. минˉ1 в течение 15 мин, добавляют пенициллин и стрептомицин из расчета 100-200 ЕД/мл и после проверки на стерильность используют для зараже-

ния

Отбор крови для серологических исследований. Для серологической диаг-

ностики необходимо иметь сыворотки двух проб крови (парные сыворотки), взя-

24

тых в начале и в конце болезни. Первую пробу берут как можно раньше - в инку-

бационный период или в начале проявления клинических симптомов болезни,

вторую - во время выздоровления или через 2-3 нед после заболевания. Брать кровь и готовить сыворотку необходимо стерильно, нельзя применять антикоагу-

лянты или консерванты, которые могут сделать сыворотку антикомплементарной,

а в РН оказать инактивирующее действие на вирус или оказаться токсичными для культур клеток либо просто нестерильными. Кровь в объеме 10-15 мл берут в сте-

рильные пробирки с резиновыми пробками, выдерживают при комнатной темпе-

ратуре до образования сгустка, обводят стеклянной палочкой (или другим инст-

рументом) и переносят в холодильник при 4 С° на 18-20 ч. После максимальной ретракции сгустка сыворотку отсасывают, добавляют антибиотики - пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл, проводят высевы на бактериологические среды.

Вместо отстаивания в холодильнике можно после обведения кровь центрифуги-

ровать. Хранить сыворотки необходимо в холодильнике при 4 С° или в заморо-

женном состоянии, строго соблюдая порядок нумерации и соответствия записей в журнале и пробах.

Перечень контрольных вопросов:

1.Методы консервации вирусов.

2.Упаковка патологического материала.

3.Общие принципы отбора патологического материала на вирусные инфек-

ции.

4. Подготовка органов и тканей для вирусологического исследования.

Тема 1.2. Индикация вирусов в патологическом материале путем обна-

ружения вирионов и телец – включений

Цель: изучить методы выявления вирусов из патологического материала.

Содержание:

индикация вирусов в патологическом материале путем вирусоскопии.

индикация вирусов в патологическом материале путем обнаружения те-

лец-включений.

25

Вирусоскопия - метод микроскопического исследования морфологии вируса.

Морфологию вирусов изучают следующими методами электронной микроскопии:

ультратонких срезов, негативного контрастирования и оттенения металлами.

Метод ультратонких срезов позволяет установить строение вируса на срезе,

тип его нуклеиновой кислоты, способ проникновения в клетку и выхода из неё, а

также место размножения в клетке.

Метод негативного контрастирования даёт высокое разрешение и позво-

ляет изучить форму и размеры вирионов, структурную организацию их оболочек.

Для негативного контрастирования используют очищенные и концентрированные препараты вирусов. Из контрастирующих веществ чаще применяют соли фосфор-

но-вольфрамовой и кремнийвольфрамовой кислоты.

Метод оттенения металлами (золотом, платиной и др.), происходит испаре-

ние в вакуумё, что позволяет установить размеры и форму вирусов, используя длину полученной тени и угол, под которым велось оттенение.

Световая микроскопия – использование световых лучей. Она подразделя-

ется на обычную, фазово-контрастную, поляризационную, люминистентную,

ультрафиолетовую.

Электронная микроскопия – применяют поток электронов. Материалы предварительно контрастируют веществами, интенсивно рассеивающими элек-

троны. Для контрастирования в процессе фиксации для липидов и белков исполь-

зуют четырёхокись осмия, для фосфолипидов - перманганат калия, для углеводов

– рутений красный. В момент фиксации препарат окрашивают уранилацетатом и фосфорно-вольфрамовой кислотой.

По схеме строения электронный микроскоп аналогичен световому, но осве-

щение объекта обеспечивает не луч света, а поток электронов от вольфрамовой нити, нагреваемой электрическим током. Разрежающая способность современных электронных микроскопов – 0,2 – 0,4 нм, рабочее увеличение в среднем – 100000

раз. Принцип действия электронного микроскопа основан на бомбардировке объ-

екта пучком электронов. Электронный микроскоп состоит из электронной пушки

(источник электронов), электромагнитных катушек (системы линз: конденсорная,

26

объективная и проекционная), предметного столика, экрана для изображения и окуляра. Для работы микроскопа необходим вакуумный насос, т.к. движение электронов возможно только в вакууме. Объект помещают перед объективной линзой и пучок электронов, формирующейся конденсорной линзы проходит через объективную линзу с определенным углом отклонения. Внизу находится флуо-

ресцирующий кран, перед проекционной линзой образуется промежуточное изо-

бражение и из этой линзы пучки идут на флуоресцирующий экран, где появляется четкое изображение.

Иммуноэлектронная микроскопия - обнаруживают вирионы в исследуе-

мом материале и специфические конгломераты вирусов и антител.

Тельца-включения при вирусных заболеваниях: морфология, состав, рас-

положение в клетке, значение.

При репродукции многих вирусов в клетках образуются внутриклеточные вирусные тельца-включения. Они могут быть цитоплазматическими и внутри-

ядерными. По природе это или скопление многих тысяч вирионов, оставшихся в клетке, или клеточный материал, изменившийся под действием репродукции ви-

рионов, или избыток вирусных белков, не вошедших в состав вирионов, или ком-

бинация этих элементов (чаще всего). Размер телец-включений колеблется от едва заметных до размеров клеточного ядра, а количество - от одиночных до 10-12 на одну клетку. Тельца-включения, образуемые в клетках некоторыми вирусами, по-

лучили специальные названия. Так, тельца-включения, образуемые вирусом бе-

шенства в цитоплазме нервных клеток, называются тельцами Бабеша-Негри, об-

разуемые в цитоплазме эпителиальных клеток вирусами оспы птиц - тельцами Боллингера, а оспы млекопитающих - тельцами Гварниери, вирусом чумы плото-

ядных - тельцами Лентца, вирусом инфекционного ларинготрахеита кур - тель-

цами Зейфреда.

Как правило, РНК-содержащие вирусы образуют цитоплазматические, а

ДНК-содержащие - внутриядерные тельца-включения. Небольшая группа вирусов вызывает образование телец-включений обоих типов.

27

Способность к окраске теми или иными красителями, размеры, форма, струк-

тура и местоположение в клетке телец-включений, образованных разными виру-

сами, неодинаковые, но специфичные для каждого вируса. Поэтому обнаружение в материале от больных животных внутриклеточных телец-включений с опреде-

ленными характеристиками позволяет судить о том, каким вирусом они образова-

ны, а значит, и о присутствии этого вируса в исследуемом материале.

Для некоторых вирусных болезней (бешенство) обнаружение телец-

включений настолько специфично (патогномонично), что позволяет судить о виде инфекции. В большинстве же случаев обнаружение вирусных телец-включений -

лишь вспомогательный метод диагностики.

Для обнаружения телец-включений готовят мазки или отпечатки (посмертно или прижизненно), которые подвергают специальным методам окраски с после-

дующей микроскопией. Проводят окраску по Муромцеву (для обнаружения, телец Бабеши-Негри). Мазки и отпечатки готовят из нефиксированного мозга. Кусочек аммонова рога растирают до гомогенной массы и делают грубые мазки на обез-

жиренные стекла. Мазков должно бить не менее 4, т.к. при малом количестве те-

лец, их можно обнаружить не в каждом мазке. Фиксируют 1-2 часа - помешают мазки или отпечатки в банку с жидкостью и плотно закрывают крышкой, чтобы не было испарения. Вынимают из фиксатора, промывают дистиллированной во-

дой и погружают в раствор синька Мансона на 5-10 мин. Мазок становится сине-

фиолетовым. Не промывая, мазок переносят в раствор танина для дифференциро-

вания, которое продолжают до тех пор, пока мазок не приобретет голубой цвет.

Промывают мазок водой, обсушивают и на несколько секунд помещают в спирт.

Смотрят под иммерсией без покровного стекла. Тельца фиолетово-розового цвета с базальной зернистостью. Эритроциты красные. Ядра синие, ядрышки темно-

синие. Нервная ткань светло-голубая.

Окраска по Селлерсу. Применяют за рубежом. На влажный мазок или отпеча-

ток наливают на 10 с. краску специального состава (краска + спирт), смывают проточной водой и просматривают под иммерсией (или под покровным стеклом).

28

Тельца красно-фиолетового цвета. Эритроциты розово-желтые. Ядра и ядрышки

голубые. Клетки розовые.

Перечень контрольных вопросов:

1.Что такое тельца-включения

2.Какие тельца образуются при бешенстве.

3.Тельца Боллингера образованы каким вирусом.

4.Методы окраски телец-включений.

Тема 1.3. Лабораторные животные и их использование в вирусологии

Цель: изучить способы применения лабораторных животных в вирусологиче-

ской практике.

Содержание:

цели использования лабораторных животных в вирусологии;

виды лабораторных животных;

требования, предъявляемые к лабораторным животным;

уход за животными и их содержание;

техника безопасности при работе с лабораторными животными;

метка лабораторных животных;

методы экспериментального заражения лабораторных животных;

признаки размножения вируса в организме лабораторного животного;

вскрытие лабораторных животных.

Полученный от зараженного животного вируссодержащий материал счи-

тают выделенным вирусом.

В организме экспериментально зараженных животных вирус накапливается.

Это используют для его изучения, идентификации, для получения гипериммун-

ных сывороток или для получения противовирусных вакцин.

Поддержание вирусов в течение многих лет в активном состоянии удается путем чередования пассажей вирусов на живых системах (в том числе на лабора-

торных животных) и хранение их в консервирующих условиях (при любом спосо-

бе консервации вирусы с той или иной скоростью теряют свою активность). Но-

29

вый пассаж вируса позволяет ее восстановить. Пассаж - заражение чувствитель-

ной живой системы с целью получения от нее новой популяции вируса. Такой ви-

рус снова хранят в консервирующих условиях.

При работе с вирусом необходимо знать его инфекционный титр, т.е. его концентрацию в материале. Ее можно определить заражением чувствительных к исследуемому вирусу живых систем (в том числе лабораторных животных) раз-

ными разведениями вируссодержащего материала.

Виды лабораторных животных: кролики, морские свинки, белые крысы, бе-

лые мыши, золотистые хомячки; куры, голуби, котята, щенки и т.д. При особо чувствительных вирусах: МРС, КРС, свиньи и т.д. Так, биопробу при оспе птиц ставят на курах, оспе овец - на овцах, чуме свиней - на подсвинках.

Требования к лабораторным животным.

1.чувствительность к вирусу;

2.возраст животного;

3.линейные животные - это животные, полученные в результате близкород-

ственного скрещивания в течение ряда поколений, такие животные становятся на-

столько генетически однородными, что и их реакция на то или иное воздействие будет одинаковой;

4.лабораторные животные должны быть здоровы. Животные, поступающие

ввиварий вирусологической лаборатории, должны быть привезены из благопо-

лучного по инфекционным заболеваниям хозяйства. Их содержат изолированно,

т.е. в карантине (белых мышей и крыс 14 дней, а остальных животных 21 день).

Животные-гнотобиоты - свободные от микроорганизмов, получают и вы-

ращивают их в стерильных условиях для экспериментальных работ. Гнотобиота-

ми называются также стерильные животные, специально заражённых определён-

ными видами микроорганизмов. Применяют в производстве высокоспецифиче-

ских диагностических сывороток, при испытании фармакологических и биологи-

ческих препаратов.

СПФ-животные - животные без специфических патогенных факторов, ли-

шённых патогенных микробов.

30