Изолирование этанолом, подкисленным щавелевой кислотой

50,0-100,0 биоматериала измельчают и заливают абсолютным этанолом, подкисляя щавелевой или винно-каменной кислотой до рН=2-3. Перемешиваем и проверяем значение рН, настаиваем при комнатной температуре в течение суток при периодическом перемешивании и проверяем значение рН. Жидкую фазу сливаем, операцию повторяем 2-3 раза (в течение 2-3 суток), затем биоматериал помещаем на фильтр и промываем спиртом; спиртовые вытяжки объединяют и упаривают на водяной бане при 40-50°С до густоты сиропа. Сиропообразную жидкость обрабатывают этанолом до прекращения выпадения осадка, жидкость фильтруют, снова упаривают до густоты сиропа и вновь осаждают белки. Остаток обрабатывают 20-25 мл воды, осадок отфильтровывают, проводят экстракцию хлороформа (203 порции), получают кислое хлороформное извлечение. Водную фазу подщелачивают 25% раствором NH4OH до рН=9-10, извлекают хлороформом (2-3) порции, получают щелочное хлороформное извлечение.

1. Для подкисления используют органические кислоты для избежания гидролиза сложноэфирных, амидных и других связей.

2. Для подщелачивания берут только NH4OH т.к. при использовании NaOH будут образовываться феноляты, ХР в воде.

Достоинства метода заключаются в следующем:

1. Метод универсален, т.к. этанол является хорошим растворителем для многих веществ этой группы (как ионизированных, так и молекулярных форм).

2. Метод предусматривает очистку извлечения от балластных веществ, в результате чего получаются чистые хлороформные извлечения, не дающие эмульсий при экстрагировании веществ из водной фазы хлороформом. Метод дает возможность изолировать до 30% барбитуратов и 20-25% алкалоидов.

К недостаткам метода следует отнести:

1. Длительность(8-10 рабочих дней) и многостадийность.

Большое количеств операций, связанных с осаждением белков и фильтрованием, ведет к значительным потерям искомых веществ (алкалоиды теряются на 25-50%).

2. Сравнительная дороговизна метода ( на 1 исследование тратится до 500 мл этанола).

Все это приводит к тому, что классический метод Стаса-Отто теряет свое былое значение и постепенно заменяется более быстрыми, эффективными и экономными методами извлечения подкисленной водой.

В настоящее время метод применяется, главным образом, для исследования гнилостно измененного биологического материала.

М-д Васильевой	М-д Стаса-Отто
Подготовка объекта к исследованию (взятие навески, измельчение, перенос в емкость)	Подготовка объекта к исследованию (взятие навески, измельчение, перенос в емкость)
Экстракция вещ-в из твердого тела в жидкость (проводится водой, подкисленной винной или щавелевой к-той до рН 2-3 3 раза)	Экстракция вещ-в из твердого тела в жидкость (проводится спиртом этиловым 96%, подкисленным винной или щавелевой к-той до рН 2-3 3 раза)
Очистка от соэкстрактивных вещ-в (процеживание вытяжки через тройной слой марли, центрифугирование)	Очистка от соэкстрактивных вещ-в (упаривание объединенной вытяжки до густоты сиропа, осаждение белков абсолютным этанолом)
Экстракция жидкость-жидкостная (трехкратная экстракция хлороформом из кислой водной вытяжки – кислое хлороформное извлечение КХИ; произв барбитуровой, салициловой к-ты, пурина)	Экстракция жидкость-жидкостная (трехкратная экстракция хлороформом из кислой спиртовой вытяжки – кислое хлороформное извлечение КХИ;
Подщелачивание кислой водной вытяжки раствором аммиака до рН 9-10; проводим трехкратную экстракцию со щелочной вытяжки хлороформом – щелочное хлороформное извлечение ЩХИ; алкалоиды и синтетические ЛС)	Подщелачивание кислой спиртовой вытяжки раствором аммиака до рН 9-10; проводим трехкратную экстракцию со щелочной вытяжки хлороформом – щелочное хлороформное извлечение ЩХИ; алкалоиды и синтетические ЛС)