Лабы / Литература для подготовки / Поливанова_ВЭЖХ_БАВ

исходном образце, осаждаются из воздуха и т.п.) и могут загрязнить колонку и ухудшить её хроматографические свойства. Хотя современные колонки содержат на входе специальные фильтры, предохраняющие их от механических примесей, проведение данной процедуры значительно увеличивает срок их службы.

Очистка растворов от механических примесей проводится либо фильтрованием (чаще всего через специальные шприцевые фильтры), либо центрифугированием; причём в некоторых случаях проводят центрифугирование с использованием специальных фильтрующих вставок

(рис. 25).

Рис. 25. Очистка пробы от механических микропримесей

На рис. 26 – 28 приведены некоторые примеры общих схем пробоподготовки для определения содержания различных лекарственных препаратов в крови.

Рис. 26. Пробоподготовка при прямом определении в крови фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, этосукцимида, карбамазепина и метотрексата

41

Пробоподготовка в лабораторном практикуме

При подготовке пробы раствора анализируемого вещества предельная допустимая концентрация раствора составляет 1 мг/мл. Образцы с большей концентрацией будут перегружать колонку, ухудшать её качество и срок службы, а получаемые количественные данные анализа будут недостоверными.

1)В зависимости от условий задачи, готовят растворы исследуемых веществ.

2)Далее по 1 мл раствора отбирают в пробирки типа «Эппендорф».

3)Пробирки с растворами помещают в барабан центрифуги, закрывают крышкой и центрифугируют 2–3 мин при скорости 8000 об/мин. Извлекать пробирки из барабана следует только после полной остановки вращения, пользуясь пинцетом, аккуратно, не взбалтывая раствор.

4)Из пробирок с помощью пипетки-дозатора отбирают от 30 до 50 мкл раствора, переносят в пробирку автодозатора, закрывают крышкой и помещают

вячейку автодозатора. При отборе раствора носик наконечника дозатора нужно помещать в среднюю область пробирки (при отборе раствора со дна или с верхнего слоя раствора в пробирке есть вероятность забора механических примесей, которые были отделены при центрифугировании).

4.3. Проведение анализа на жидкостном хроматографе

Подготовка прибора к работе

После запуска на компьютере управляющей программы «АльфаХром» и включения хроматографа в сеть, необходимо удостовериться в том, что хроматограф опознан программой и с ним есть связь (в нижней строке программы должна появиться надпись «Готов»).

Далее проверяется наличие элюентов в ёмкостях «А» (водный раствор

0.2 М LiClO4 и 0.005 M HClO4) и «Б» (ацетонитрил) (рис. 23), а также растворителей в промывочных пробирках, установленных на автодозаторе (дистиллированная вода и ацетонитрил).

Перед началом анализов необходимо провести ряд обязательных процедур для того, чтобы удостовериться в исправности узлов хроматографа и готовности колонки к работе. Для этого необходимо войти в диалоговое окно «Ручные операции» (иконка в виде руки на верхней панели программы) и провести ряд операций:

1)операция «промывка 3×500 мкл» проводится в том случае, если прибор длительное время (более 2-х недель) не эксплуатировался. Это необходимо для заполнения раствором элюента жидкостной системы прибора и устранения в ней пузырьков воздуха (жидкостная система включает насосы, краны, датчики давления, все трубопроводы и соединения).

2)операция «проверка на герметичность» проводится каждый раз перед началом серии анализов. Это необходимо для того, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков в жидкостной системе и её герметичности. После запуска процедуры (кнопкой «проверка на герметичность») прибор набирает

43

небольшое количество элюента, инжекционная игла устанавливается в специальную заглушку на автодозаторе и насосы включаются на подачу. В рабочем поле программы открывается окно, в котором в реальном времени отображается график давления в системе от времени. При нормальном состоянии системы давление на графике скачком повышается до 6–7 атм и поддерживается на данном уровне. Необходимо убедиться, что давление не будет падать больше чем на 1 атм в течение 30 с, затем процедуру можно остановить (кнопка стоп «▄» на верхней панели программы).

После выполнения первых двух операций необходимо:

3)«включить» термостат.

4)«промыть инжектор» (задаётся объём промывки 500 мкл, скорость потока при промывке 200 мкл/мин, состав элюента Б – 100 %)

4)«промыть иглу» (игла автоматически поочередно промывается в двух промывочных пробирках с ацетонитрилом и дистиллированной водой, установленных на автодозаторе).

Б – 100 %).

После проведения обязательных подготовительных операций можно приступать к серии анализов.

Последовательность процедур при анализе

Для того, чтобы задать метод проведения хроматографического анализа необходимо открыть диалоговое окно «Серия анализов».

Условия метода анализа (скорость потока при элюции, состав элюента, температуру колонки), а также условия работы детектора устанавливают либо вручную, либо загружают заранее подготовленный и сохранённый файл с методом анализа. Для того, чтобы загрузить файл с методом анализа, выбирают функцию «загрузить метод анализа» в диалоговом окне и выбирают файл с необходимым методом хроматографического анализа.

После задания метода анализа необходимо заполнить данные в окне «таблица автодозатора». Для этого первоначально создают в таблице количество строк в соответствии с количеством образцов в данной серии анализов (кнопки «добавить строку в конец» и «удалить последнюю строку»). Далее заполняют информацию в строках: указывают положение пробирки на автодозаторе, задают объём отбираемой пробы (4–5 мкл), записывают комментарии к анализируемому образцу (название анализируемого соединения, концентрация стандартного образца в пробе и т.п.).

Когда все данные диалогового окна заполнены, активируют команду «начать анализ» и во всплывающем диалоговом окне подтверждают своё решение («да»), после чего хроматограф приступает к проведению анализа в соответствии с заданной разработчиками прибора программой и выбранными оператором условиями хроматографического анализа.

44

Последовательность процедур при завершении работы

После проведения анализов перед выключением прибора необходимо выполнить следующие процедуры:

-войти в диалоговое окно «ручные операции»;

-запустить команду «промыть колонку» (объём промывки обычно задается около 1000 мкл/мин, скорость потока при промывке 150 мкл/мин, состав элюента Б – 100 %);

-запустить команду «слив элюентов в сборник».

После завершения последней процедуры выключить прибор из сети.

4.4. Работа в программе тренажёр «Жидкостной хроматограф»

Компьютерная программа тренажёр «Жидкостной хроматограф» эмулирует работу хроматографа типа «Милихром А-02» с учётом его технических параметров, метрологических характеристик, типичных ошибок оператора и погрешностей эксперимента.

Компьютерная программа включает все этапы хроматографического анализа. После запуска программы открывается рабочее поле, содержащее меню с основными действиями программы:

-«Подготовка тренажёра к работе и схема хроматографа». В данном разделе программы представлена интерактивная управляемая схема хроматографа и возможна наглядная виртуальная имитация его работы.

-«Характеристики хроматографа». При запуске данной команды открывается окно с техническими характеристиками прибора.

-«Подготовка образца». При запуске данной опции открывается таблица

снабором веществ, предлагаемых для проведения виртуального анализа. Выбранное вещество помечают галочкой и переходят к команде «Перейти к подготовке образца» (кнопка в нижнем правом углу диалогового окна). В следующем диалоговом окне указывают количество виртуальной навески вещества в мг и активируют команду «взять навески». Далее выбирают растворитель в соответствии с физико-химическими свойствами вещества и объём мерной колбы для растворения навески (при приготовлении стандартных растворов веществ необходимо строго учитывать массу навески и объём мерной колбы!), активируют команду «растворить навески». Выбирают необходимый тип фильтра и активируют команду «фильтровать» (при проведении реальных анализов вместо фильтрования используют центрифугирование раствора образца). Устанавливают количество мкл раствора образца, переносимое в пробирку автодозатора (около 50 мкл), номер гнезда автодозатора, куда будет установлена виртуальная пробирка, и нажимают кнопку «ОК». При необходимости готовят ещё один образец

(команда «приготовить ещё образец») или активируют команду «перейти к анализу».

При активации команды «перейти к анализу» (как показано выше) или команды «управление хроматографом» (на главной панели программы)

45

запускается программа «Альфахром». Работа в данной программе описана в предыдущем разделе. Управление хроматографом в режиме тренажёра полностью идентично работе в реальных условиях.

4.5. База данных для высокоэффективного жидкостного хроматографа

ЗАО Институт хроматографии «ЭкоНова» разработана унифицированная хроматографическая методика, которая позволяет автоматически проводить качественное и количественное определение нескольких сотен (около 500) лекарственных, ядовитых, сильнодействующих, наркотических, взрывчатых, токсичных и других веществ. При этом не требуются перенастройка хроматографа для анализа разных групп веществ и стандартные образцы сравнения. Все хроматографические данные об образцах уже внесены в электронную базу данных «ВЭЖХ-УФ».

Для того чтобы провести анализ исследуемой субстанции (кровь, моча, пищевые продукты, неизвестное вещество и прочие образцы) на наличие в их составе какого-либо вещества из имеющихся в базе данных, необходимо:

-провести полное тестирование хроматографической системы по специальной методике (валидация прибора);

-подготовить образец и выполнить анализ по методике, разработанной для базы данных;

-обработать хроматограмму в программе «МультиХром» и получить отчёт

овеществах, обнаруженных в пробе, и их концентрациях;

Хроматографическая система для проведения анализов на хроматографах «Милихром А-02» и «Альфахром» по базе данных включает:

-элюенты: А – раствор 0.2 М LiClO4, 0.005 M HClO4; Б – ацетонитрил, градиентное элюирование проводится по утвержденному разработчиками методу анализа, содержащемуся в файле БД_2003.mtd;

-колонку: заполнена сорбентом марки ProntoSil120-5-18C AQ, внутренний диаметр 2 мм, длина 75 мм.

4.6.Обработка хроматограмм

Программа обработки хроматограмм «МультиХром» обеспечивает большой спектр расчётов при обработке хроматограммы. Подробное описание работы всего программного комплекса изложено в специальном руководстве пользователя. В данном разделе описаны основные операции, необходимые для выполнения лабораторных работ.

В рамках лабораторного практикума «высокоэффективная жидкостная хроматография» для решения поставленных задач требуется освоить: методику валидации прибора перед проведением анализов по базе данных, методику качественного и количественного определения вещества по базе данных, а также методику построения градуировочных графиков на основании серии записанных хроматограмм.

46

Валидация хроматографического анализа

Важнейшим этапом разработки методов анализа, оценивающим их пригодность и достоверность, является валидация. В широком смысле валидация – это подтверждение путём экспертизы и представления объективного доказательства того, что особые требования, предназначенные для конкретного применения, соблюдены.

В случае работы на хроматографах «Милихром А-02» и «Альфахром» процедура валидации выполняется для подтверждения того, что конкретная хроматографическая система (хроматограф, элюенты и колонка) соответствует всем параметрам, при которых была сформирована электронная база данных «ВЭЖХ-УФ», а данные, полученные в результате проведенных на этом приборе анализов, можно сопоставлять и обрабатывать на основе параметров, записанных в базе данных.

Таким образом, после прохождения процедуры валидации можно производить качественный и количественный анализ веществ в образцах по базе данных без использования стандартных образцов сравнения (хроматографические параметры стандартных образцов сравнения уже имеются в базе данных).

Для проведения валидации записывается хроматограмма тестовой смеси – раствора, содержащего бромид калия, уридин, кофеин, м-нитроанилин, о-нитроанилин с заданными концентрациями. Полученная хроматограмма переносится из программы «Альфахром» в программу «МультиХром» (кнопка «обработать в МультиХром» на верхней панели программы). После того, как записанная хроматограмма отобразится в программе «МультиХром», в меню спектры необходимо активировать команду «отчёт по валидации». Программа выдаст таблицу с указанием основных параметров, по которым осуществляется валидация хроматограммы и данных об их соответствии стандартным значениям. При соответствии всех параметров валидации записанной хроматограммы стандартным значениям можно приступать к проведению анализов и идентификации веществ по базе данных. В табл. 4 представлены параметры тестирования хроматографической системы при валидации.

Таблица 4

Параметры тестирования хроматографической системы при

Sλ – площадь пика хроматограммы, записанной при длине волны λ.

47

Качественное и количественное определение вещества

Записанная хроматограмма переносится из программы «Альфахром» в программу «МультиХром» (кнопка «обработать в МультиХром» на верхней панели программы). После выполнения этой команды записанная хроматограмма отобразится в программе «МультиХром». В зависимости от сложности спектра возможны различные действия с хроматограммой. Режим «редактор пиков» позволяет откорректировать границы пиков при их наложении друг на друга или при сильном размывании. В меню «обработка/переразметить» можно увеличить значение минимальной высоты пика, воспринимаемой прибором (пики с высотой меньшей, чем это установленное значение будут восприниматься прибором как шум и не будут идентифицироваться). Эта команда полезна при анализе сложных хроматограмм, в которых необходимо отсечь все мелкие пики примесей.

С помощью команды «мастер распознавания» в меню «спектры» можно провести предварительный качественный анализ каждого пика по базе данных, а чтобы сгенерировать полный (качественный и количественный) отчёт по базе данных, необходимо активировать команду «спектральный отчёт» в том же меню. Если хроматографические характеристики какого-либо пика анализируемой хроматограммы совпадут с хроматографическими данными вещества, имеющегося в базе данных, в отчете будут указаны результаты качественного и количественного анализа для соответствующего компонента анализируемой смеси.

Все операции, связанные с качественным и количественным определением компонентов анализируемой смеси не по базе данных, сгруппированы в подменю «градуировка» в меню «метод».

Для выполнения количественного анализа интересующего вещества в пробе необходимо построить градуировочный график. Для построения градуировочного графика используют не менее трех растворов анализируемого вещества с известной концентрацией (не менее трех градуировочных точек), которые готовят используя стандартный образец данного вещества. После записи хроматограмм этих растворов первая хроматограмма переносится в программу «МультиХром». Далее активизируют команду «компоненты» в меню «метод» и подменю «градуировка» (или активизируют пиктограмму в виде пробирки на верхней панели программы). После этого в нижней половине окна появится незаполненная таблица компонентов смеси. С помощью команды «добавить» в таблицу добавляют необходимое число строк (по числу имеющихся компонентов в градуировочной хроматограмме). В столбец «пик» вводят номер пика анализируемого вещества согласно хроматограмме. В столбец «имя» вводят название компонента.

Далее создаётся таблица концентраций. Для этого нажимают кнопку «концентрации» в верхней строке таблицы компонентов; в появившуюся таблицу добавляют градуировочные точки. Для этого нажимают кнопку «добавить» и в всплывающем окне ставят флажок напротив фразы

«градуировать сразу по рабочей хроматограмме». Затем нажимают «ок»,

48

после чего окно закрывается, а в таблице появляется новый столбец, куда вводят значение концентрации раствора для данной хроматограммы. Далее снова нажимают «ок» (таблица концентраций закрывается). После этого хроматограмму и метод необходимо сохранить, для этого последовательно выбирают команды в меню «файл»: «записать» а «хроматограмма» и «записать» а «метод».

Эти же операции производят для всех последующих хроматограмм градуировочной серии. После добавления последней градуировойной точки можно наглядно отобразить полученный график. Для просмотра графика нажимают соответствующую кнопку в таблице «компоненты». В всплывающем окне можно увидеть график, построенный по градуировочным точкам.

Для качественного и количественного определения интересующего компонента в анализируемой смеси готовят пробу и записывают хроматограмму, используя тот же метод, что и при записи градуировочных хроматограмм. После получения хроматограммы её переносят в программу «МультиХром», активизируют последовательно кнопки «компоненты» а «концентрации». В всплывающем окне в таблице концентраций в столбце «эта хроматограмма» программа отображает значение концентрации компонента, рассчитанное на основании построенного градуировочного графика.

Вывод отчёта о проведённом хроматографическом анализе

Полученные данные можно отобразить в отчёте. Для этого активизируют команду «обработка» а «выдать отчёт» или «метод» а «настройка отчёта». В появившемся окне отмечают параметры, которые хотят вынести в отчёт. В окне метода расчёта выбирают «Абсолютная градуировка». Отмечают устройства, на которые будет выведен отчёт (например, экран или принтер), выделив галочками соответствующие поля в верхней части окна. Можно предварительно посмотреть общий вид отчёта (кнопка «Просмотр»). Для вывода отчёта нажимают кнопку «Отчёт».

49

5.Задания для лабораторного практикума

5.1.Качественное определение вещества по базе данных «ВЭЖХ-УФ»

1)Получить у лаборанта образец для анализа и раствор тестовой смеси для проведения валидации прибора.

2)Включить и подготовить прибор к работе.

3)Приготовить раствор неизвестного вещества для проведения анализа.

4)Подготовить для анализа раствор тестовой смеси.

5)Провести валидацию прибора.

6)Записать хроматограмму неизвестного вещества (по методу базы данных «ВЭЖХ-УФ»).

7)Провести обработку хроматограммы и идентификацию вещества по базе данных «ВЭЖХ-УФ» в программе «МультиХром».

8)Подготовить отчёт по проведённому анализу.

5.2 Качественный и количественный анализ готовой формы лекарственного препарата

1)Получить у лаборанта готовую форму, инструкцию по применению и стандартный образец активного компонента лекарственного препарата.

2)Приготовить раствор препарата для проведения анализа.

3)Приготовить три раствора с известной концентрацией препарата (к

примеру, 0.1, 0.3 и 0.6 мг/мл).

4)В программе тренажёр «Жидкостной хроматограф» подобрать оптимальные условия записи хроматограммы для основного активного компонента лекарственной формы (оптимизировать время (объём элюентов) и скорость проведения анализа) и сохранить данный метод.

5)Записать хроматограммы растворов с известной концентрацией анализируемого вещества (по оптимальному методу) и построить градуировочный график концентрационной зависимости в программе «МультиХром».

6)Записать хроматограмму приготовленного раствора лекарственного препарата (по оптимальному методу).

7)Определить содержание действующего вещества в лекарственной форме используя полученный градуировочный график.

8)Сравнить полученные данные с данными, заявленными в инструкции к данному препарату. Сделать выводы. Подготовить отчёт по проведённому анализу и лабораторной работе в целом.

50