диссертации / 90

4

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AIC (Akaike's information criterion) – информационный критерий Акаике

A-SAA (acute-phase serum amyloid A) - сывороточный амилоид А острой фазы

DIGE (2-D Difference Gel Electrophoresis) – дифференциальный электрофорез в геле

FGF-2 – (fibroblast growth factor 2) - фактор роста фибробластов 2

FPRL1(formyl peptide receptor-like 1) – белок, подобный формилпептидному рецептору 1

HDL (high-density lipoprotein) - липопротеид высокой плотности

IGF-II (Insulin-Like Growth Factor 2) – инсулиноподобный фактор роста II IL (interleukin) – интерлейкин

IPI (international protein index) - международный индекс белков

ITHC4 (inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain) – тяжелая цепь интер-альфа-

трипсинового ингибитора

LR (logistic regression) - логистическая регрессия

MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) –

опосредованная матрицей времяпролетная лазерная десорбция/ионизация

M-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor) - макрофагальный колонии-

стимулирующий фактор

MMP (matrix metalloproteinase) - матриксная металлопротеиназа

NAGK (N-acetylglucosamine kinase) - N-ацетилглюкозаминкиназа

NF-kB (nuclear factor kappa B) - ядерный фактор каппа В

OPN –остеопонтин

PPV (positive predictive value) - положительная оценка предсказания

RFE (Recursive Feature Elimination algorithm) - алгоритм рекурсивного исключения признаков

SELDI-TOF (Surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight ) – усиленная поверхностью времяпролетная лазерная десорбция/ионизация

SVM (Support vector machine) - метод опорных векторов

TNF (tumor necrosis factor alpha) - фактор некроза опухолей альфа

5

TSP (top scoring pairs) - метод пар с наибольшим счетом

TTR-транстиретин

СА125 (cancer antigen 125) - раковый антиген 125

6

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В конце ХХ века злокачественные опухоли женской репродуктивной системы во всем мире стали одним из главных факторов отрицательных демографических тенденций. Наиболее фатальной из них является рак яичников.

В структуре умерших от злокачественных новообразований рак яичников занимает 6-е место. Ежегодно в мире регистрируется свыше 225 тысяч новых случаев злокачественных новообразований яичников и более 140 тысяч их них умирают. В России в 2012 году зарегистрировано 12,9 тысяч новых случаев злокачественных новообразований яичников ( 35 новых больных в сутки).

Прирост абсолютного числа заболвших составил 3% за период с 2006 по 2011

год. Пик смертности (6,7%) пришелся на возраст 40-59 лет [1,81].

Пятилетняя выживаемость больных варьирует в зависимости от стадии заболевания: при начальных стадиях рака яичников составляет 70-85% и только лишь 18-35% при поздних стадиях заболевания. При этом практически у 70-80%

больных рак яичников впервые диагностируются в III-IV стадиях. В среднем пятилетняя выживаемость больных составляет 35-40% [1,50,51,81].

Основными причинами столь неутешительных статистических тенденций является бессимптомное течение рака яичников на ранних стадиях и, как следствие, крайне низкий уровень его ранней диагностики, малоэффективное лечение, особенно при рецидивах заболевания [5,9,14,15] .

Стратегия повышения эффективности ранней диагностики рака яичников предполагает проведение скрининга женского населения - массового и селективного (обследование групп риска). Для осуществления таких мероприятий требуются простые, надежные и дешевые скрининговые методы, которые, к

сожалению, пока отсутствуют [2,9,10,27,33,60].

Большие надежды в 90-х годах прошлого века возлагались на маркер рака яичников СА125. Однако, как оказалось, чувствительность этого биомаркера

7

составляет не более 65%. Известно большое количество и других сывороточных маркеров рака яичников, однако, ни один из них сам по себе не обладает высокой точностью, что, по-видимому, связано с гетерогенной этиологией рака яичников и сложным составом сыворотки крови [18,22,113,114].

Интенсивное развитие протеомных технологий в начале ХXI века открыло новые перспективы для поиска биомаркеров заболеваний. Одной из наиболее перспективных технологий, используемых в этих целях, является масс-

спектрометрия белковых чипов SELDI-TOF-MS (surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry - усиленная поверхностью времяпролетная лазерная десорбция/ионизация масс-спектрометрия) -

экспрессный и высокоселективный метод для анализа белков и пептидов, который обладает высокой воспроизводимостью результатов. В настоящее время масс-

спектрометрия находит все более широкое применение в медицине. Благодаря этому методу возникло новое направление - клиническая протеомика, которая занимается инвентаризацией белков человека, кодируемых его генами, дополняя,

таким образом, геномные исследования. Именно состав белков определяет функциональное назначение каждой клетки, в том числе и опухолевой, а также отражает реализацию возможностей проявления имеющихся наследственных или приобретенных генетических дефектов. Изменение концентрации отдельных белков указывает на появление патологии и может быть использовано в диагностических целях. В настоящее время основной идеологией поиска новых малоинвазивных способов диагностики онкологических заболеваний, в том числе и рака яичников, является разработка диагностических систем на основе протеомного профилирования сыворотки крови для идентификации опухолевых маркеров [23,26,98].

Особый интерес вызывает сывороточный амилоид А острой фазы (A-SAA).

Несмотря на то, что этот белок давно известен как маркер воспаления, он обладает рядом уникальных свойств. Во-первых, его концентрация в сыворотке крови в норме в 10-100 раз ниже, чем концентрация других опухолевых маркеров.

Во-вторых, при воспалении его концентрация увеличивается в 100 раз и более,

8

тогда как концентрация большинства других маркеров меняется сравнительно слабо. В-третьих, известно, что A-SAA синтезируется в тканях некоторых злокачественных опухолей [30,44,57]. Кроме того, была показана способность амилоида A индуцировать экспрессию транскрипционного фактора NFκB [48],

играющего ведущую роль в блокировании апоптоза и матриксных металлопротеиназ MMP1, MMP3 и MMP9, вызывающих деградацию межклеточного матрикса и тем самым способствующих ангиогенезу и метастазированию [4,64,65,79].

Вышеизложенные научные факты побудили нас предпринять клинико-

экспериментальное исследование, направленное на поиск новых маркеров рака яичников с использованием, как традиционных (ИФА), так и новейших протеомных (масс-спектрометрия SELDI-TOF) технологий.

Следует отметить, что проведение настоящего исследования было поддержано Государственным контрактом от 28 февраля 2006 года №02.442.11.7426 в рамках Федеральной целевой научно-технической программы: «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы» - «Белок сывороточный амилоид А как потенциальный маркер для ранней протеомной диагностики рака яичника».

Цель исследования

Изучить возможности повышения эффективности дифференциальной диагностики опухолей гениталий и своевременной диагностики рака яичников на основе использования комбинации сывороточных белков A-SAA и СА125.

Задачи исследования

1.Проанализировать и сформировать исследуемую выборку пациенток, отвечающую требованиям разработки адекватного диагностического метода и банк образцов их сывороток крови.

9

2.Методом иммуноферментного анализа определить концентрации СА125 и

А-SAA в сыворотке крови пациенток исследуемой выборки.

3.Провести масс-спектрометрическое профилирование (SELDI-TOF)

сывороток крови пациенток исследуемой выборки в условиях,

оптимизированных для измерения уровня А-SAA.

4.Определить чувствительность масс-спектрометрической детекции А-SAA в

сыворотке крови пациенток исследуемой выборки.

5.На основе многофакторного анализа оценить возможность использования в качестве сывороточного маркера рака яичников А-SAA, определяемого методом масс-спектрометрии отдельно и в комбинации со значениями концентраций А-SAA и СА125, измеряемых методом иммуноферментного анализа.

Научная новизна исследования

Показана применимость масс-спектрометрического метода для распознавания сывороток крови больных раком яичников, доброкачественными опухолями яичников, миомой матки и здоровых женщин.

Определена чувствительность масс-спектрометрии SELDI-TOF для определения белка А-SAA в составе сыворотки крови.

На основе многофакторного анализа комбинации данных масс-

спектрометрической детекции А-SAA и значений концентраций А-SAA и СА125,

измеренных методом иммуноферментного анализа, впервые разработана экспериментальная система диагностики рака яичника, точность которой составляет 95,2%.

10

Научно-практическая значимость исследования

Разработанная экспериментальная система протеомной диагностики опухолей яичника является научно обоснованной предпосылкой для создания и внедрения в практику аппаратно-программного комплекса, который целесообразно использовать для скрининга и ранней диагностики рака яичников.

Рассчитанные пороговые значения диагностически значимых маркеров способствуют повышению точности дифференциальной диагностики овариальных образований.

Положения диссертации, выносимые на защиту

1.Точность распознавания сывороток крови больных раком яичников,

доброкачественными опухолями яичников, миомой матки и здоровых женщин методом масс-спектрометрии SELDI-TOF составляет 89,5%.

2.Сывороточный А-SAA, определяемый методом масс-с пектрометрии

SELDI-TOF, я вляется м аркером р ака я ичника при критическом значении его концентрации 0,3 г/л (2,6×10-5 М), обладая чувствительностью

50% и специфичностью 96,4%.

3.Добавление к даннымм асс-с пектрометрической детекции A-SAA

данных о концентрациях A-SAA и СА125, измеряемых методом иммуноферментного анализа, повышает точность диагностики рака яичников до 95,2%.

Внедрение результатов исследования в практику

Материалы диссертации доложены на 4-м Ежегодном Всемирном Конгрессе

международной организации «Протеом человека» (HUPO 4-th Annual World