диссертации / 90

21

исследованных сывороток. Это указывает на невозможность использования СА125 для ранней диагностики рака яичников [50].

Вместе с тем, при II, III и IV стадиях рака яичников уровни СА125

повышаются и могут использоваться для мониторинга заболевания. Наблюдаемое повышение уровней СА125 при рецидивах заболевания свидетельствует о необходимости мониторинга всех больных, находящихся в ремиссии, т.к. лишь у

1-й из 10-ти больных результат исследования бывает ложноотрицательным. Более того, даже если при первичном обследовании у нелеченных больных показатели СА125 не превышали норму, то в процессе ремиссии анализ на содержание маркеров в крови необходим в связи с возможным вторичным повышением маркеров при рецидиве. В этом плане, безусловно, перспективным является определение СА125 в период ремиссии и при рецидиве заболевания. Повышение уровня маркера от нуля (либо от базального уровня) до 35 ед/мл, т.е. в пределах нормы, может быть доклиническим проявлением рецидива [9]. .

Было показано, что у всех пациенток с уровнем СА125 менее 1/2 ДК (ДК дискриминационная концентрация маркера, равная 35 ед/мл) и ежемесячным приростом менее 20% от предыдущего значения маркера, рецидив в ближайшие 6

месяцев не наблюдался. Если прирост превышал 20%, то рецидив был диагностирован в среднем через 46 мес. У пациенток со значением СА125 от 0,5

до 1 ДК и приростом свыше 20% в месяц рецидив регистрировался в среднем через 24 месяца. Если же значение маркера превышало ДК, а его прирост был свыше 20%, то рецидив можно было обнаружить спустя 13 месяцев [9,17].

Использование СА125 позволяет не только диагностировать наличие рецидива с достаточно высокой точностью, но и с большей вероятностью прогнозировать его развитие. Чувствительность СА125 при рецидиве заболевания составляет 97%. При полной ремиссии в отсутствие опухоли уровень СА125

должен быть близким к нулю. Однако, несмотря на перечисленные недостатки,

из-за отсутствия лучшего метода клинической диагностики, СА125 широко

22

используют в диагностической практике в сочетании с ультразвуковым исследованием [17].

Рак яичников хорошо поддается лечению до того как появляются его первые клинические симптомы. Важнейшей задачей является оценить преимущества и недостатки существующих методов скрининга рака яичников,

модифицировать их. Необходимо оптимизировать критерии для выявления женщин, находящихся в группе риска по развитию рака яичников, и сделать их обследование максимально углубленным. Не вызывает сомнений тот факт, что женщины в постменопаузальном периоде находятся в группе риска по сравнению с более молодыми женщинами. Лица с мутациями генов BRCA1 и BRCA2

значительно чаще болеют II типом эпителиального рака яичников.

Следовательно, они нуждаются в более частом обследовании. Стоит отметить, что рутинный гинекологический осмотр не может считаться методом скрининга рака яичников. В исследовании PLCO за 5 лет не было обнаружено ни одного случая рака яичников, используя исключительно гинекологический осмотр. Рак яичников пальпируется менее чем в 30% случаев под анестезией [99]. Важнейшим недостатком определения СА-125 является низкая чувствительность на ранних этапах развития рака яичников. Уровень СА-125 был повышен только у 10 из 31

женщины с раком яичников I или II стадии, диагностированных методом трансвагинального УЗИ [36,102] .

При прогрессирующем раке яичников уровень СА-125 повышается более чем у 80% больных. В исследовании PLCO 74% пациенток с повышенным уровнем СА-125 имели III или IV стадию заболевания. В связи с этим в алгоритм скрининга рака яичников включено не только абсолютное значение СА-125, но также и скорость прироста концентрации СА-125. В свою очередь трансвагинальное УЗИ является наиболее эффективным методом скрининга ранних стадий рака яичников. В исследовании PLCO 72% случаев ранних стадий

23

рака яичников были обнаружены исключительно методом трансвагинального УЗИ. Более того, около двух третей всех случаев рака яичников выявляется методом трансвагинального УЗИ. Важнейшим недостатком УЗИ является его низкая прогностическая ценность. Трансвагинальное УЗИ точно указывает на изменение объема и морфологии яичников, но не указывает на доброкачественный или злокачественный характер опухоли. В исследовании

PLCO прогностическая ценность трансвагинального УЗИ составила <3%. Другим недостатком трансвагинального УЗИ является отсутствие изменения объема яичника при некоторых видах рака. Тем самым на УЗИ яичник визуализируется нормальным, в то время как рак уже развивается (ложноотрицательный результат скрининга). В случае подозрения на рак яичника женщина должна быть тщательно обследована перед оперативным вмешательством [80].

Идея использования диагностических скрининговых тестов у женщин без клинических симптомов, находящихся в группе высоко риска по развитию рака яичников, является фундаментально важной для снижения смертности от рака яичников. Появление клинических симптомов рака яичников свидетельствует о том, что болезнь уже достаточно развита. Хотя комбинация СА-125 и

трансвагинального УЗИ теоретически повышает диагностическую ценность,

следует признать, что чувствительность, специфичность и полезная прогностическая ценность этих методов не являются оптимальными. Пока не появятся более точные скрининговые тесты в диагностике рака яичников,

приходится использовать комбинацию СА-125 и трансвагинальное УЗИ.

Обязательным требованием к трансвагинальному УЗИ является исследование маточных труб, эпителий которых является предшественником II типа рака яичников. Уровень биомаркеров должен включать не только абсолютное значение, но также и скорость прироста концентрации. Для повышения эффективности хирургического лечения следует унифицировать диагностический

24

и лечебный алгоритмы [5,6,80].

1.4. Использование новейших технологий в поиске

биомаркеров, ассоциированных с опухолями яичников

Основными характеристиками биомаркеров являются: чувствительность,

специфичность и положительная оценка предсказания (positive predictive value, PPV). Чувствительность – это процент пациентов, классифицированных с использованием данного маркера как «больные раком», от общего числа действительно больных пациентов. Специфичность – это процент пациентов,

классифицированных с использованием маркера, как «здоровые», от общего числа действительно здоровых пациентов. Положительная оценка предсказания – это процент правильно диагностированного рака от общего числа диагнозов «рак» [23].

Для того чтобы маркер можно было использовать в практике, должны быть достаточно велики показатели его чувствительности и специфичности. Удобно использовать для характеристики биомаркеров понятие точности диагностики,

под которой подразумевается процент правильных диагнозов [50].

Распространенным подходом к увеличению чувствительности и специфичности метода диагностики является совместное использование нескольких маркеров. Для создания системы диагностики на основе набора биомаркеров необходимо использовать методы многомерной статистики и вырабатывать более сложный алгоритм классификации [89].

Из методов биоинформатики чаще всего применяют методы логистической регрессии, построения классификационного древа и дискриминантный анализ.

Метод логистической регрессии позволяет на основе экспериментальных данных вывести формулу, включающую в качестве переменных концентрации

25

биомаркеров. Метод дискриминантного анализа позволяет аппроксимировать на основе экспериментальных данных многомерную плотность вероятности для распределения здоровых и больных. Модель, построенная с помощью дискриминантного анализа, возвращает вероятность признака «рак» на основе отношения плотностей вероятности для признаков «рак» и «отсутствие рака».

Построение классификационного древа основано на поэтапном включении в классификацию нескольких биомаркеров. Сначала экспериментальные данные делятся на две группы на основе уровня одного из маркеров, затем каждая из ветвей расщепляется на две на основе концентраций других биомаркеров и так продолжается до тех пор, пока каждой конечной точке не будет сопоставлен диагноз («рак», «отсутствие рака» или «доброкачественная опухоль») [89].

Предпринимались многочисленные попытки использовать в комбинации с СА125 для диагностики рака яичника белки, известные как биомаркеры различных видов рака: СА15-3 (маркер рака молочной железы) [50,89,112], СА72-

4 (маркер рака поджелудочной железы) и M-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor - макрофагальный колонии-стимулирующий фактор) – цитокин,

стимулирующий пролиферацию лимфоцитов, липид-ассоциированную сиаловую кислоту (LASA), известную как маркер рака мозга [55] и рака молочной железы

[24] и некоторых других видов рака, OVX1 – маркер рака эндометрия [111], CA9 –

маркер рака почек, а также CA54/61, являющийся маркером рака яичника [32].

Однако все упомянутые маркеры обладают низкой специфичностью для конкретного вида рака, и их концентрация во многих случаях изменяется по сравнению с нормой и при раке яичника.

Использование панелей из 4-5 указанных белков позволило улучшить специфичность и чувствительность метода, по сравнению с одним СА125: для ранней стадии рака яичников удалось повысить чувствительность от 45% до 70%

при неизменной специфичности [89], для отличия доброкачественных и

26

злокачественных опухолей яичников - с 78,1% и 76,8% соответственно, до 90,6%

и 93,2%, соответственно [19,58,59]. Таким образом, было четко показано,

использование не одного, а набора биомаркеров является перспективным подходом к диагностике.

Поиск панелей биомаркеров, а также комбинирование биомаркеров,

обнаруженных разными методами, является основной идеологией большинства современных исследований в области разработки биохимических диагностических методов. Существует множество различных подходов к поиску биомаркеров злокачественных опухолей. Часть из них основаны на анализе непосредственно опухолевой ткани и выявлении опухоль-специфических продуктов, другие направлены на выявление биомаркеров в крови. Современные высокопроизводительные биотехнологические методы позволяют проводить транскриптомное и протеомное профилирование биологического материала, что позволяет получать информацию одновременно о большом количестве генов или белков. Транскриптомное профилирование (ДНК-микрочипы) позволяют сравнивать профиль экспрессии генов в клетках больных и здоровых. Анализ профиля экспрессии генов в основном используют для исследования молекулярных механизмов развития рака [104], определения молекулярных различий между гистологическими подтипами рака [24,90]. Достаточно широко транскриптомное профилирование используют в исследованиях устойчивости опухолей к тем или иным видам терапии, при этом ставится цель разработки персонализированного подхода к лечению злокачественных опухолей [25].

Однако использование транскриптомного профилирования для разработки новых диагностических методов достаточно ограничено, так как путь от выявления отличий на уровне транскриптома до выявления биомаркера,

доступного для измерения малоинвазивными методами, достаточно сложен.

Примером успешного обнаружения биомаркера путем транскриптомного

27

профилирования является работа Le Page с соавторами. Обнаружив повышение экспрессии генов IL-18 и FGF-2 в тканях рака яичника, авторы измерили методом иммуноферментного анализа концентрацию соответствующих белков и обнаружили достоверное повышение их уровня, как в ткани яичника, так и в крови [63].

С развитием протеомных технологий открылись совершенно новые перспективы по выявлению белковых маркеров рака. Протеомные технологии позволяют получать информацию сразу о больших совокупностях белков и сравнивать наборы белков у больных и здоровых людей, что дает возможность выявлять не один, а сразу несколько маркеров. В применении протеомных технологий к выявлению биомаркеров можно условно выделить два разных подхода. Первый подход использует новые технические возможности только для поиска новых маркеров с лучшими характеристиками и их дальнейшей идентификации. После этого можно использовать найденные маркеры иммунными или аффинными методами. Другой подход основан на сравнении протеомного профиля в целом для больных и здоровых людей с привлечением статистических методов для выявления значимых различий, не выявляя их причин [83]. При этом диагностическим признаком является сам состав протеомного профиля, то есть исследования и непосредственная диагностика могут проводиться одним и тем же методом [109].

Среди протеомных методов, используемых для непосредственного обнаружения и идентификации биомаркеров, существенную роль играет двумерный электрофорез с последующей масс-спектрометрической идентификацией белков. Метод двумерного электрофореза позволяет осуществлять разделение белков в одном направлении путем изоэлектрофокусирования, а в другом направлении – по массе [7].

В качестве материала для двумерного электрофореза часто используют не

28

кровь, а непосредственно опухолевые и нормальные ткани исследуемого органа.

Однако как здоровые, так и опухолевые ткани представлены различными типами клеток, что усложняет воспроизводимость и интерпретацию результатов. Решить эту проблему в значительной степени позволило изобретение метода лазерной микродиссекции, с помощью которого можно отделить интересующую клеточную популяцию от окружающих тканей [34,108].

Помимо классического двумерного электрофореза для обнаружения маркеров заболеваний используют также его усовершенствованные варианты,

например, дифференциальный электрофорез в геле (DIGE). Белковые экстракты из больной и здоровой тканей метят двумя различными флуоресцентными зондами и смешивают. Затем проводят двумерный электрофорез, после чего для каждого пятна измеряют интенсивность флуоресценции и определяют различие в интенсивности между двумя флуоресцентными метками. Такой подход позволяет достичь полной идентичности условий проведения электрофореза и за счет этого повысить воспроизводимость результатов [100,115]. Двумерный электрофорез также применяют для скрининга сыворотки больных раком с целью выявления белков, связывающихся с аутоантителами к белкам раковых клеток [83,108].

Большие перспективы имеет технология микрочипов на основе антител,

которая представляет собой одновременный анализ сотен белков в пробе на микрочипах с иммобилизованными антителами. Примером успешного поиска биомаркеров рака яичника с использованием микрочипов на основе антител представляет собой работа Mor с соавторами. С их помощью были проанализированы уровни 169 белков у 28 здоровых женщин, 18 женщин с впервые диагностированным раком яичника и 40 женщин с рецидивом рака яичника. Были обнаружены достоверные отличия между сыворотками больных раком и сыворотками здоровых женщин в концентрациях 35 из 169

исследованных белков. Затем концентрации белков с наиболее выраженными

29

различиями между раком и нормой, а также с достаточно ясной потенциальной ролью в процессе злокачественного перерождения были определены с помощью иммуноферментного анализа. В результате в качестве биомаркеров были отобраны лептин, пролактин, остеопонтин (OPN) и инсулиноподобный фактор роста II (IGF-II). Уровень пролактина и OPN существенно повышен у больных раком яичника, в то время как уровень лептина и IGF-II понижен. Совместное использование четырех перечисленных биомаркеров позволило достичь чувствительности и специфичности диагностики 95%. Недостатком использования микрочипов на основе антител относится высокая стоимость расходных материалов и необходимость иметь антитела ко всем анализируемым белкам. Кроме того, использование антител в большинстве случаев не позволяет различить между собой различные посттрансляционные модификации белков, а

также фрагменты белков [74 ].

Этими недостатками не обладают масс-спектрометрические методы,

которые очень активно развиваются и с успехом применяются для поиска биомаркеров злокачественных опухолей, в том числе, рака яичника. Масс-

спектрометрические методы позволяют получать спектры распределения белков в смеси по массе. При этом каждому белку соответствует определенный пик,

положение которого определяется соотношением массы и заряда белка, а

интенсивность неявным образом отражает количество белка. Во всех масс-

спектрометрических методах белки должны быть предварительно ионизованы. В

случае так называемой MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time- of-flight, опосредованная матрицей времяпролетная лазерная десорбция/ионизация) это достигается добавлением к белкам органической матрицы, являющейся донором протонов. Матрица взаимодействует с белками и формирует кристаллоидную структуру. При облучении этой структуры лазером ионизованные индивидуальные молекулы белков отрываются от поверхности и

30

движутся к катоду. Чем меньше по массе и чем сильнее заряжен белок, тем быстрее он достигает противоположно заряженного электрода, по времени движения иона до электрода определяют соотношение массы и заряда белка. При облучении лазером образуются преимущественно однозарядные ионы, и для них

соотношение массы и заряда примерно совпадает с массой [7].

Методы масс-спектрометрии позволяют очень быстро анализировать большое количество образцов, требуют сравнительно небольшого количества биологического материала, обладают высокой чувствительностью и хорошим разрешением для низкомолекулярных белков и пептидов, что делает особенно

перспективным их использование для поиска биомаркеров [83].

Из прямых масс-спектрометрических методов для обнаружения биомаркеров заболеваний лучше всего приспособлена технология SELDI-TOF,

совмещающая в себе масс-спектрометрическую детекцию белков с использованием белковых чипов. Белковый чип представляет собой пластинку с

8-ю пятнами хроматографической поверхности, на которую наносят образцы исследуемой жидкости перед анализом. Используются чипы с различной хроматографической поверхностью: гидрофильной (нормально-фазовые),

гидрофобной (обращенно-фазовые), анионообменные, катионообменные или металлоаффинные. Кроме того, существуют чипы с активированной поверхностью для связывания любого аффинного сорбента. В зависимости от типа чипа и используемого буфера с активной поверхностью связывается разный набор белков, а не связавшиеся белки отмываются. После отмывки чип со связавшимися белками высушивают и наносят на матрицу, помещают в вакуумную камеру, а пятна облучают лазером. Ионизованные за счет энергии лазера белки отрываются от поверхности чипа, по вакуумной трубке летят к