диссертации / 32

111

Блокада CBR-2 во время гипоксии существенных изменений стратегии поиска цели не изменяла. Следовательно, именно CBR-1 вносят значительный вклад в нейропротекторный эффект N-ADA при моделировании острой гипобарической гипоксии, и несколько меньший –

TRPV1.

Таким образом, превентивное введение N-ADA при моделировании острой гипобарической гипоксии способствует сохранению структур мозга, ответственных за воспроизведение долговременной памяти. Современные исследования мозга свидетельствуют, что актуализация следов памяти требует одновременной активации многих структур мозга, каждая из которых выполняет специфическую функцию по отношению к процессам памяти. Процессы памяти связывают с фронтальной, височной и париетальной корой, мозжечком, базальными ганглиями, миндалиной и, особенно, гиппокампом (Morris, 1982). В этих же структурах наблюдается наибольшая плотность экспрессии каннабиноидных рецепторов первого типа

уживотных и человека (Хаспеков, Бобров, 2006; Herkenham, 1991).

Врезультате проведенного исследования нами было показано, что превентивное применение N-ADA способствует сохранению мнестических функций ЦНС животных в постгипоксическом периоде. Антигпоксический эффект при гипобарической гипоксии реализуется преимущественно за счет активации CBR-1 и TRPV1.

112

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена изучению антигипоксического и нейропротекторного эффекта эндоканнабиноида N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии в первичной культуре клеток гиппокампа мышиных эмбрионов и острой гипобарической гипоксии мышей in vivo.

В экспериментах in vitro было проведено комплексное исследование функциональной сетевой активости нейронов гиппокампа с применением современных электрофизиологических и имиджинговых методик, позволяющих изучить биоэлектрическую и химическую (кальциевую) активность нервных клеток. Применение мультиэлектродных систем регистрации внеклеточных потенциалов действия in vitro позволило провести долговременное исследование спонтанной биоэлектрической активности нейронных сетей и регистрацию мгновенных ответов в ответ на воздействие различных факторов, в том числе дефицита кислорода в среде. Благодаря применению методики функционального кальциевого имиджинга с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии проведено неинвазивное прижизненное исследование изменения содержания ионов Са2+ в цитоплазме диссоциированных клеток гиппокампа.

На сегодняшний день изучение роли различных эндоканнабиноидов в составе стресс-лимитирующей системы поддержания гомеостаза сетевой активности нейронов представляет имеет важное значение как для теоретической, так и для практической науки о мозге. На различных моделях черепно-мозговой травмы, ишемического поражения мозга, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и эксайтотоксичности in vitro и in vivo было продемонстрировано, что различные эндоканнабиноиды, такие как анандамид и 2-арахидоноилглицерин, N- арахидоноилдофамин, так же, как и синтетические лиганды каннабиноидных рецепторов, как, например, WIN55121-2, оказывают нейропротекторное действие при различных видах повреждения головного мозга (Nagayama et

113

al., 1999; Sinor et al., 2000; Panikashvili et al., 2001; Moesgaard et al., 2003; Eljaschwitsch et al., 2006; Maresz et al., 2007; Mechoulam and Shohami, 2007; Bobrov et al., 2008; Koch et al., 2010; Генрихс и др. 2010; Grabiec et al., 2012; Pazos et al., 2013; Chiarlone et al., 2014; Dhopeshwarkar & Mackie, 2014). В то же время, данные о механизмах нейропротекторного действия эндоканнабиноидов, в том числе N-арахидоноилдофамина (N-ADA), и о вкладе конкретных каннабиноидных рецепторов в реализацию этого действия подчас противоречивы и недостаточно полны.

В данной работе показано, что гипоксическое воздействие вызывает необратимое снижение спонтанной сетевой биоэлектрической активности культивируемых нейронов гиппокампа, вплоть до ее практически полного прекращения к 7-м суткам (число малых сетевых пачек снизжалось в 16,5 раз относительно исходного уровня), что свидетельствует о нарушении синаптических связей в нейронных сетях. Также происходило угнетение спонтанной кальциевой активности клеток (доля клеток, проявляющих спонтанную кальциевую активность на 7 день постгипоксического периода, снижалось в 6,3 раза по сравнению с интактными культурами). Количество жизнеспособных клеток в культурах сокращалось в 4,3 раза. Соедовательно, существенное снижение уровня спонтанной биоэлектрической и кальциевой активности связано с гибелью части нейронов в постгипоксическом периоде, редукцией синаптических контактов и разрушением нейронных сетей.

N-ADA, апплицированный во время гипоксии и в первые сутки постгипоксического периода, препятствовал необратимым изменениям нейросетевой биоэлектрической и кальциевой активности, а также гибели культивируемых нейронов в течение как минимум 7 суток после гипоксии. В группе опытных культур, при аппликации N-ADA, доля клеток, проявляющих кальциевую активность, составляла 45,1±8,77% что было достоверно выше, чем в контрольной группе культур, подвергшихся гипоксическому воздействию (19,06±7,01%). Также аппликация N-ADA частично устраняла изменения длительности кальциевых осцилляций в

114

клетках, демонстрирующих появление суперосцилляций в постгипоксическом периоде. Максимальным защитным действием N-ADA обладал в концентрации 10 мкМ.

Показано, что в отдаленном постгипоксическом периоде in vitro N- ADA сохраняет высокий уровень жизнеспособных нервных клеток, доля которых в присутствии N-ADA, составило 75,24±9,37%, что достоверно выше, чем в контрольных культурах (20,84±4,78%).

Для выявления молекулярных механизмов нейропротекторного и антигипоксического действия N-ADA нами было проведено исследование роли различных рецепторов, с которыми он может взаимодействовать. Обнаружено, что антигипоксическое действие N-ADA опосредуется прежде всего через каннабиноидные рецепторы 1 типа (CBR-1) и ванилоидные рецепторы (TRPV1). Активация каннабиноидных рецепторов 2 типа (CBR-2) оказывает менее выраженный нейропротекторный эффект при гипоксии in vitro. Применение блокатора CBR-1 римонабанта (SR141716A, 1 мкМ) полностью устраняло нейропротекторный эффект, оказываемый N-ADA на жизнеспособность клеток и поддержание ими биоэлектрической активности в период гипоксии. Блокада TRPV1 капсазепином (1 мкМ) также препятствовала защитному эффекту N-ADA, количество жизнеспособных клеток в данной группе экспериментальных культур не отличалось от показателей контрольной группы, подвергавшейся гипоксии. Через сутки после моделирования нормобарической гипоксии с аппликацией N-ADA и капсазепина число пачек сетевых импульсов снижалось в 10 раз, однако дальнейшего снижения спонтанной биоэлектрической активности не происходило и такой уровень активности сохранялся не изменным вплоть до 7 суток постгипоксического периода. Применение блокатора CBR-2 (SR144528, 1 мкМ) менее существенно влияло на нейропротекторный эффект N-ADA. Количество жизнеспособных клеток, как и уровень биоэлектрической активности в группах при аппликации N-ADA и N-ADA в сочетании с блокатором CBR-2, не отличались друг от друга, однако

115

происходило достоверное изменение паттерна активности нейронов. Количество спайков в пачке и их частота уменьшалось на 45,8% и 40,8% на первые сутки и на 52,1% и 36,8% на седьмые сутки, соответственно.

Было исследовано распределение CBR-1 и CBR-2 в культурах клеток гиппокампа при воздействии острой нормобарической гипоксии. Впервые было показано, что введение N-ADA в культуральную среду во время гипоксии и в первые сутки после нее предотвращает изменения размеров и количества кластеров CBR-2 и увеличивает количество кластеров CBR-1, сохраняя их нормальные размеры.

На основании ключевой роли активации CBR-1 в реализации нейропротекторного и антигипоксического эффектов N-ADA можно предположить, что в их основе лежит реализация механизма ретроградного ингибирования выброса нейромедиаторов, в первую очередь, возбуждающего нейромедиатора глутамата (Kreitzer, Regehr, 2001). Активация пресинаптических каннабиноидных рецепторов тормозит кальциевые токи через пресинапптические потенциал-зависимые Са2+-каналы N- и P/Q-типов, в результате подавляется пресинаптическое высвобождение глутамата (Szabo, 2008; Kano et al., 2009; Castillo et al., 2012), что приводит к нормализации концентрации кальция в постсинаптическом окончании, вследствие чего, вероятно, в наших экспериментах отмечалось уменьшение длительности кальциевых суперосцилляций. Предотвращение гиперактивации NMDA-Rs путем ингибировая выброса глутамата из пресинаптических терминалей – один из наиболее изученных механизмов защиты нервных клетки от нейротоксичности (Sánchez-Blázquez et al., 2014).

При исследовании антигипоксических свойств N-ADA in vivo было установлено, что превентивное внутрибрюшинное введение N-ADA в дозах 6 мг/кг и 10 мг/кг достоверно повышает время жизни животных «на высоте», Время жизни на высоте у контрольных животных составляло 5,82±1,06 мин, максимальный эффект отмечен у группы, получавшей N-ADA 10 мг/кг, время жизни «на высоте» увеличилось в 1,5 раза по сравнению с

116

контрольной группой и составляло в среднем 8,95±0,55 мин. Также превентивное внутрибрюшинное введение N-ADA увеличивало долю высокорезистентных к гипоксии животных (при введение N-ADA во всех исследованных дозах в опытных группах отсутствовали низкоустойчивые к гипоксии животные) и их выживаемость на «смертельной площадке», при максимальном защитном эффекте N-ADA в дозе 10 мг/кг, сопоставимом с эффектом реамберина. Коэффициент защиты реамберина (150 мг/кг)

составил 1,5, тогда как N-ADA в дозах 2,5, 6 и 10 мг/кг – 1,16, 1,33 и 1,58,

соответственно.

Нами было выявлено, что гипоксическое повреждение вызывает достоверное снижение двигательной активности у животных, получавших инъекцию физиологического раствора, на первые сутки после моделирования гипоксии с последующим ее восстановлением к 14 суткам постгипоксического периода. Двигательная активность животных, получавших инъекцию растворителя N-ADA на 14 сутки была достоверно ниже, чем у интактной группы. Превентивное внутрибрюшинное введение N- ADA предотвращало вызванное гипоксией снижение двигательной активности. При использовании N-ADA в дозах 2,5 и 6 мг/кг двигательная активность уже на первые сутки после гипоксии не отличалась от уровня активности интактных животных. На 14 сутки во всех опытных группах уровень двигательной активности не отличался от интактной группы. Аналогичная картина наблюдалась и у животных при введении реамберина.

Таким образом, превентивное внутрибрюшинное введение N-ADA при острой гипобарической гипоксии дозозависимо повышает время жизни животных «на высоте», долю высокорезистентных к гипоксии животных и их выживаемость на «смертельной площадке» и предотвращает в дальнейшем изменения двигательной активности, индуцированные гипоксией. Максимальный защитный эффект N-ADA наблюдался в дозе 10 мг/кг. Полученные данные свидетельствуют о том, что N-ADA обладает

117

выраженным антигипоксическим эффектом, сопоставимым с действием известного антигипоксического препарата Реамберина.

Для выявления действия N-ADA на сохранение мнестических функций ЦНС животных при гипоксическом повреждении нервной системы, было проведено тестирование животных в водном лабиринте Морриса, показавшее, что острая гипобарическая гипоксия вызывает грубые нарушения мнестических функций, проявляющихся в ухудшении долговременной памяти и изменении стратегии поиска цели. Коэффициент сохранения памяти снижался с 31,87±3,74 у интактных животных до 21,01±5,1 и 19,95±3,36 в контрольных группах, в которых были отмечены особи, получившие отрицательный результат поска цели, при этом большая их часть осуществляла поиск хаотически. Применение известного антигипоксанта Реамберина не оказывало действия на структуру пространственной памяти, в то время как превентивное внутрибрюшинное введение N-ADA сохраняло мнестические функции, достоверно повышая значение отсроченного коэффициента сохранения долговременной памяти по сравнению с группой сравнения. Наилучший эффект отмечен при использовании N-ADA в дозе 10 мг/кг, коэффициент сохранения памяти составил 34,17±7,43, особей с отрицательным поиском цели не обнаружено, наибольшая доля особей (60%) представляли животные с активным поиском цели с учетом научения.

Таким образом, результаты исследований in vivo свидетельствуют, что N-ADA обладает антигипоксическим действием, способствует сохранению воспроизведения долговременной памяти и предотвращает мнестические нарушения у животных после гипоксического воздействия. Также выявлен важный вклад CBR-1, и несколько меньший – TRPV1, в поддержание мнестических функций ЦНС при моделировании острой гипобарической гипоксии. Блокада этих рецепторов при гипоксии устраняла нейропротекторный эффект N-ADA, проявляющийся в сохранении стратегий поиска цели в водном лабиринте Морриса.

118

Отсутствие эффекта блокады CBR-1, CBR-2 и TRPV1 на активность нейроной сети гиппокампа и жизнеспособность клеток интактных культур in vitro и поведение интактных животных in vivo еще раз подтверждает гипотезу о включении механизма обратной связи и активацию пресинаптических каннабиноидных рецепторов только при гипоксии.

Полученные результаты указывают на перспективу использования N- ADA в качестве фармакологического агента для предотвращения гипоксического повреждения мозга.

119

ВЫВОДЫ

1.N-ADA обладает антигипоксическим действием, способствуя сохранению уровня биоэлектрической активности нейронной сети в диссоциированных культурах клеток гиппокампа, структуры сетевой пачки импульсов во время острой нормобарической гипоксии in vitro и в постгипоксическом периоде.

2.N-ADA оказывает антигипоксический эффект на индуцированные гипоксией in vitro изменения спонтанной кальциевой активности нейронной сети, выражающийся в поддержании числа клеток, проявляющих активность,

атакже частичной нормализации длительности и частоты кальциевых осцилляций в постгипоксическом периоде.

3.Превентивная аппликация N-ADA (10 мкМ) предотвращает вызванную гипоксией гибель культивируемых клеток гиппокампа после гипоксии/реоксигенации.

4.Введение N-ADA во время гипоксии/реоксигенации in vitro предотвращает снижение размеров и числа кластеров каннабиноидных рецепторов 2 типа и повышает число кластеров каннабиноидных рецепторов 1 типа, сохраняя их нормальные размеры.

5.При превентивном парентеральном введении N-ADA оказывает антигипоксический эффект, способствуя сохранению двигательной активности и долговременной пространственной памяти после острой гипобарической гипоксии у мышей линии С57BL/6. Максимальный антигипоксический эффект оказывает применение N-ADA в дозе 10 мг/кг.

6.Ключевую роль в реализации антигипоксического и нейропротекторного эффектов N-ADA играет активация каннабиноидных рецепторов 1 типа (CBR-1) и ванилоидных рецепторов (TRPV1) и, в меньшей степени, каннабиноидных рецепторов 2 типа (CBR-2).

120

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2-АГ (2-AG) – 2-арахидоноилглицерин

АМПА (AMPA) - α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота

АНА (ANA) - анандамид АЦ – аденилатциклаза

ВДА - вертикальная двигательная активность ГАЖК (FAAH) - гидролаза амидов жирных кислот ГАМК (GABA) - γ-аминомасляная кислота

ГДА - горизонтальная двигательная активность ДАГ – диацилгдицерол Вж –выживаемость Кз – коэффициент защиты

КФЛМ - конфокальная лазерная микроскопия МАГЛ (MAGL) - моноацилглицетроллипаза НМДА (NMDA) – N-метил-D-аспатрат

ОГБГ – острая гипобарическая гипоксия оКс – отсроченный коэффициент сохранения памяти ТГК - 9-тетрагидроканнабинол Тж – время жизни «на высоте» Тпп - время потери позы Твп - время восстановления позы

цАМФ – циклический аденозин монофосфат ЦНС – центральная нервная система ФлА2 - фосфолипаза А2 ФНОα - фактор некроза опухолей α ЭК – эндоканнабиноид

ЭКС – эндоканнабиноидная система ЭПР - эндоплазматический ретикуллум