диссертации / 21

диагнозом врожденная миопатия «центрального стержня» и 18 пациентов в возрасте от 4 месяцев до 16 лет, средний возраст составил 9,9±0,75 с диагнозом митохондриальная миопатия.

Биопсии у здоровых людей не проводились, в связи с относительной серьезной инвазивностью хирургической процедуры взятия биопсии.

Исследование было ограничено сравнением показателей, полученных при биопсии скелетных мышц у детей с различными заболеваниями: врожденной миопатией «центрального стержня» и митохондриальной миопатией.

Клиническими критериями отбора пациентов служили: данные анамнеза,

клинического осмотра лабораторных исследований (исследования сахарной кривой, концентраций пирувата и лактата в сыворотке крови, уровня креатинина,

общего и ионизированного кальция в периферической крови и тд.).

Окончательным определяющим фактором для включения больного в группу исследования служили результаты патоморфологического анализа биоптата скелетной четырехглавой мышцы бедра, выданные научно-исследовательской лабораторией общей патологии научно-исследовательского клинического института педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Минздрава России.

Ограниченное количество обследованных больных объясняется тем, что эти наследственные болезни относятся к категории орфанных заболеваний. Так,

частота встречаемости болезни центрального стержня варьирует по разным данным от 3 до 6 на 100000 человек. Частота митохондриальных болезней еще мало изучена.

2.2Методы исследования

Всоответствии с поставленными задачами в работе были использованы биохимические и морфологические методы исследования.

51

2.2.1 Биохимические исследования

Биохимические исследования были проведены в Научно-исследовательском клиническом институте педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Минздрава России. Из результатов проведенных биохимических исследований были проанализированы следующие показатели: уровень молочной и пировиноградной кислот (Ммоль/л), концентрация креатинина (Ммоль/л),

лактатдегидрогеназы (ЛДГ Ед/л) и концентрация общего кальция (Ммоль/л) в

крови. Биохимический анализ крови был проведен натощак. В качестве нормы показателей крови использовали данные, представленные в руководстве для врачей Н.Д. Ющука, Ю.Я. Венгерова (2009) (табл.1). Биохимические показатели были полученны в клинико-диагностической лаборатории (зав. лаборатории Т.В.

Акапова) НИКИ педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова.

Биохимические параметры крови исследовали на автоматическом анализаторе

«Финпипет» (Финляндия).

Определение уровня молочной и пировиноградной кислот в крови проводили с помощью энзиматического метода Rollinghoff (1967) натощак и после стандартной нагрузки глюкозой (из расчета 1,75 г/кг массы тела, но не более 50 г) на 60 и 180 минутах. Принцип определения молочной кислоты основан на ее дегидрировании лактатдегидрогеназой (ЛДГ) в присутствии никотинамиддинуклеотида (НАД). По количеству образовавшегося восста-

новленного никотинамиддинуклеотида (НАДН ), определенного спектрофото-

метрически, судили о содержании молочной кислоты, т.к. реакция проходит стехиометрически – 1 моль НАД на 1 моль молочной кислоты дает 1 моль НАДН .

Принцип определения пировиноградной кислоты основан на ее восстановлении под влиянием лактатдегидрогеназы (ЛДГ) до молочной кислоты.

При этом на восстановление 1 моль пирувата расходуется 1 моль НАДН и по изменению оптической плотности реакционной смеси при длине волны 340 нм

52

можно судить об убыли НАДН , и, следовательно, о концентрации пировиноградной кислоты.

Определение креатина крови осуществлялось энзиматическим методом.

Энзиматический метод количественного определения креатинина состоит из серии сопряженных ферментативных реакций, включая превращение креатинина в креатин под действием фермента креатинкиназы, превращение креатина в саркозин под действием креатининамидиногидролазы (креатиназы) и

последующие окисление саркозина под действием саркозиноксидазы (СОД) с

образованием перекиси водорода. В присутствии пероксидазы (ПОД) перекись водорода образует окрашенное соединение, что делает возможным ее количественное определение при длине волны 550 нм4. Содержащийся в пробе эндогенный креатин удаляется под действием креатиназы и саркозиноксидазы в процессе предварительной инкубации.

Таблица 1.

Норма биохимических показателей [Ющук, Венгеров,2009].

2.2.2 Морфологические исследования

Морфологические исследования биоптатов четырехглавой мышцы бедра были проведены с помощью следующих методов: 1) Гистоферментохимического выявления активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) по Нахласу и др; 2)

Электронно-микроскопического исследования; 3) Морфометрического анализа.

53

2.2.2.1 Гистоферментохимическое выявление активности сукцинат-

дегидрогеназы (СДГ) по Нахласу и др.

Для морфологического подтверждения диагноза миопатии «центрального стержня» и митохондриальной миопатии гистоферментохимически выявляли активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) по Нахласу и др. (1957). СДГ -

основной энергетический фермент, катализирует окисление янтарной кислоты,

позволяет с высокой степенью достоверности судить о функциональной активности всего митохондриального аппарата. Локализуется на внутренней мембране митохондрий.

Материал погружали в среду для заливки в жидкий азот фирмы Sigma и

затем в жидкий азот, где производилось их замораживание. Далее замороженный материал помещали в криостат, где осуществляли приготовление криостатных срезов толщиной 12 мкм. Приготовление основного раствора сукцината осуществлялось следующим образом: смешивались равные объемы 0,2М

фосфатного буфера (рН = 7,6) и 0,2М сукцината натрия. Затем добавляли 10 мл основного раствора сукцината к 10 мл водного раствора нитросинего тетразолия

(1мг/мл). Инкубация срезов проводилась при температуре 37°С в полученной смеси в течении 20 минут. Далее осуществлялась промывка физраствором (0,9% NaCl). После этого осуществлялась фиксация в 10% формалине в течение 10

минут. А затем промывали в 15% спирте и помещали в глицерин-желатин [Пирс, 1962].

Анализ и фотосъемка светомикроскопических препаратов производились на световом микроскопе Nikon eclipse 80i.

Оценка выраженности изменений гистофизиологической активности проводилась по балльной системе [Сухоруков, 1998].

2.2.2.2 Электронно-микроскопическое исследование

Для электронно-микроскопического исследования мышц проводили префиксацию ткани, взятой всегда в строго определенном месте (четырехглавая

54

мышца бедра) размером не более 1мм3 в 2.5%-ном растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере (рH=7.4) при 0°С. После отмывки ткани фосфатным буфером (рH=7.4) проводили фиксацию 1%-ным раствором четырехокиси осмия в течение часа при 2-4°С. Затем ткань обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (50, 70, 96 и 100%). Заливку ткани производили в эпоновую смолу после трехкратной обработки ацетоном по методике Лафта [Luft, 1961]. Срезы получали на ультратоме фирмы REICHERT Nr. 321850/E и контрастировали цитратом свинца по методике Рейнольдса

[Reynolds, 1963]. Исследование проводили на трансмиссионном электронном микроскопе JEOL JEM-100B.

Степень тяжести заболевания у больных детей оценивалась клиницистами Научно-исследовательского клинического института педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Минздрава России при помощи различных тестов мышечной активности.

2.2.2.3 Морфометрический анализ

Для каждого пациента было изготовлено 5 блоков. С каждого блока были приготовлены ультратонкие срезы. Для ультраструктурного анализа были отсняты митохондрии, располагающиеся под сарколеммой и между миофибриллами мышечных волокон при разных увеличениях от х 6000 до х

50000.

Морфометрический анализ проводился путем подсчета митохондрий,

разделенных на две популяции в зависимости от их места расположения в мышечном волокне: под сарколеммой (субсарколеммальная популяция митохондрий) и между миофибриллами (межмиофибриллярная популяция митохондрий) с помощью компьютерной программы для микрофотометрии

«Image J.» при увеличении х 10000. С каждого блока проанализировано не менее

20 полей зрения.

55

Определяли относительное количество митохондрий их размерные характеристики, такие как площадь, периметр, максимальный и минимальный диаметры Фере; показатели формы – фактор «эллипс», «округлость»; среднюю электронно-оптическую плотность и удельный объём митохондрий. Определяли среднюю площадь триад, саркоплазматических цистерн и Т-трубочек.

Параллельно определяли удельный объём миофибрилл.

В процессе работы нами был предложен показатель «энергетической обеспеченности мышечного волокна», равный отношению удельного объёма митохондрий к удельному объёму миофибрилл.

Для сравнительной оценки качества RRF мы применяли следующую 4-х

балльную систему:

1балл - только умеренное субсарколеммальное скопление метки;

2балла - умеренные межмиофибриллярные и умеренные субсарко-

леммальные скопления метки

3балла - умеренные межмиофибриллярные и грубые субсарколеммальные скопления метки

4балла - грубые межмиофибриллярные и грубые субсарколеммальные скопления метки.

2.2.3Статистическая обработка данных

Определяли средние значения и стандартные ошибки среднего для абсолютных показателей. Абсолютные показатели при условии нормального распределения сравнивали с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок, при распределении, отличном от нормального, использовали тест Манна-Уитни. Результаты наблюдений представлены в виде среднего значения ± ошибки среднего значения (M ± m),где М – выборочное среднее, m – стандартная ошибка среднего.

Для определения нормальности распределения изучаемых признаков также был рассчитан коэффициент Шапиро-Уилка [Реброва, 2003]. Поскольку распределение большинства признаков оказалось отличным от нормального, то,

56

для статистической обработки были применены непараметрические методы

[Платонов, 2000]. Для выявления взаимосвязей между изучаемыми признаками и продолжительностью воздействия возмущающих факторов был проведен ранговый корреляционный анализ Спирмена. Вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена (R) – непараметрический аналог коэффициента корреляции Пирсона, рекомендуемый для интервальных и порядковых переменных, не подчиняющихся нормальному распределению [Платонов, 2000].

Различия считались статистически значимыми при p<0,05. Статистическая обработка данных выполнена с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и

пакета прикладных программ "STATISTICA 6.0".

57

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 ГИСТОФЕРМЕНТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В СКЕЛЕТНОЙ МЫШЕЧНОЙ

ТКАНИ ПАЦИЕНТОВ

3.1.1 Гистоферментохимическое выявление активности сукцинат-

дегидрогеназы у больных врожденной миопатией центрального стержня

Была проведена гистоферментохимическая оценка активности митохондриального фермента скелетной мышечной ткани – сукцинат-

дегидрогеназы. При этом наблюдалась значительная гетерогенность распределения метки по центральным и периферическим участкам скелетных мышечных волокон.

При болезни центрального стержня активность сукцинатдегидрогеназы была выявлена в периферических участках мышечных волокон, тогда как в центральных участках наблюдалось значительное снижение активности или отсутствие этого фермента (Рис.7). Это может указывать на то, что периферические участки энзиматически активны в отличие от центральных участков мышечных волокон.

3.1.2 Гистоферментохимическое выявление активности сукцинат-

дегидрогеназы у больных митохондриальной миопатией

Анализ полученных препаратов показал, что при гистоферментохимической оценке активности сукцинатдегидрогеназы у 16 из 18 пациентов, обнаруживались участки мышечных волокон с повышенной активностью фермента (феномен

RRF), главным образом в периферических участках, а у некоторых больных и в центральных участках мышечных волокон (рис.8).

58

Рис.7. Скелетная мышечная ткань пациента с врожденной миопатией центрального стержня. Возраст 21 год. Гистохимическое выявление активности сукцинатдегидрогеназы по Нахласу и др. Ув. х100.

Стрелкой показаны «стержневые» зоны с полным отсутствием ферментативной активности в центральных участках мышечных волокон.

10 мкм

Рис.8. Скелетная мышечная ткань пациента с митохондриальной миопатией. Возраст 5 лет. Гистохимическое выявление активности сукцинатдегидрогеназы по Нахласу и др.

Стрелками показана активность фермента в мышечных волокнах.

59

3.2 ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СКЕЛЕТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ПАЦИЕНТОВ

3.2.1 Электронно-микроскопическое исследование скелетной мышечной ткани больных врожденной миопатией центрального стержня

Для более глубокого и детального анализа использовали метод электронно-

микроскопического анализа скелетной мышечной ткани в различных участках мышечных волокон. Проведенный анализ позволил выявить значительные ультраструктурные изменения волокон поперечнополосатой скелетной мышечной ткани, затрагивающие все её компоненты: миофибриллы, саркомеры,

митохондрии, саркотубулярные комплексы, Т-трубочки, саркоплазматические цистерны (триады).

При ультраструктурном анализе скелетной мышечной ткани у больных врожденной миопатией центрального стержня в центральных участках мышечных волокон были выявлены атрофические изменения пучков миофиламентов, очаги дезориентации и их расщепление (рис.9, рис.10). Такие деструктивные участки,

как правило, сопровождались вакуолизацией и деструкцией митохондрий (рис.11),

а также деструкцией т-трубочек, саркоплазматических цистерн (триад) (Рис.12,

рис.13).

У некоторых пациентов была обнаружена грубая дезориентация миофиламентов с расширением центральных пространств между ними,

заполненных мелкогранулярным материалом на фоне вакуолизации и деструкции митохондрий (рис.14).

В центральных участках со слабо выраженными вышеописанными ультраструктурными изменениями или с полным их отсутствием, были выявлены митохондрии с электронно-плотным матриксом без межмитохондриальных контактов (рис.14).

60