диссертации / 17

211

У курящих в сравнении с некурящими отмечалось достоверное сниже-

ние ЖЕЛ, ФЖЕЛ, ОФВ1/ФЖЕЛ, ПОС, МОС25, МОС50; больший прирост ОФВ1 на бронхолитик (400 мкг вентолина).

Показатель ПСВ при поступлении с обострением БА в стационар у ку-

рящих составил 59,1%, у некурящих - 65,0% (р>0,05) от нормы (80%). Дина-

мика ПСВ свидетельствовала об эффективности проводимой бронхолитиче-

ской и противовоспалительной терапии у всех больных - у некурящих боль-

ных на 5 сутки ПСВ повысилась с 65,1% до 84,5%, у курящих - с 59,1% до

77,9% (р<0,05). В то же время на 7 и 10 сутки показатели ПСВ у курящих больных всё же оставались несколько ниже, чем у некурящих (р˃0,05).

У курящих подростков в приступном периоде БА в 1,9 раза чаще возникала необходимость в назначении антибактериальной терапии, чем у некурящих (OР=1,88; 95%ДИ [1,0-3,5], р=0,03) вследствие явлений сопутствующего хронического бронхита курильщика.

Следует отметить, что выявленные нами особенности БА у курящих подростков полностью согласуются с мнением Черняка Б.А. и Иванова А.Ф.

(2011), выделивших у взрослых курящих такие «особенности БА, как частое развитие тяжелого, неконтролируемого или частично контролируемого течения заболевания; преобладание нейтрофильного характера воспаления и выраженное ремоделирование бронхов с формированием необратимой обструкции; терапевтическая резистентность к ИГКС, обусловливающая низкую эффективность базисной терапии» [107].

Анализ ассоциаций полиморфизмов генов-кандидатов c формированием бронхиальной астмы, клинико-лабораторными данными у бурят и русских,

проживающий в Забайкальском крае.

Генетическое исследование проведено нами по 9 полиморфизмам 7 ге-

нов-кандидатов развития БА (FCER2, ADRB2, TNFA, GSTM1, NOS2, NOS3 и GSDMB), а также 2 полиморфизмам 2 генов-кандидатов предрасположенности к табакокурению (THOI и CHRNA5).

212

Установлена ассоциация развития бронхиальной астмы у бурят с генами

NOS3 (VNTR) и GSDMB (rs7216389), у русских - с NOS2 (CCTTT)n, GSDMB

(rs7216389) и CHRNA5 (rs16969968) (табл. 32,33,36).

Выявлены маркеры повышенного риска формирования бронхиальной астмы сходные у подростков бурятской и русской национальности: носитель-

ство аллеля Т и гомозиготный генотип T/Т полиморфизма rs7216389 гена

GSDMB. Мы предполагали наличие ассоциаций полиморфизма rs7216389 гена

GSDMB с формированием БА, так как в большинстве популяций, в том числе у азиат эта ассоциация подтверждена многоцетровыми исследованиями с ис-

пользованием полногеномного анализа GWAS [292].

Нами определены этноспецифические маркеры заболевания:

-у бурят – носительство аллеля 4 и генотипов 4/4 и 4/5 гена NOS3 (VNTR);

-у русских больных - носительство аллелей, содержащих короткое число тандемных повторов, гена NOS2 (CCTTT)n; - гомозиготного генотипа G/G по-

лиморфизма rs16969968 гена CHRNA5.

Известно, что эндотелиальная (eNOS) экспрессируется эндотелием сосу-

дов легких. Оксид азота, продуцируемый в небольших количествах под дей-

ствием конститутивных NO-синтаз (nNOS и eNOS) ведет к цГМФ–зависимой релаксации гладкой мускулатуры бронхов. Наличие минорного генотипа *4/4

увеличивает экспрессию гена eNOS, однако синтез NO при этом подавляется вследствие нарушенной активности фермента и вместо бронхорасширяющего эффекта приводит к усилению гиперреактивности бронхов [95, 96, 171]. Алле-

ли с *8 или *9 повторами (CCTTT)n гена NOS2 имеют более низкие уровни транскрипционной активности, чем аллели с *12–*15 повторами. У носителей аллелей с более низким числом повторов продуцируется меньше iNOS и, как следствие, меньше оксида азота II (NO), чем у индивидов - носителей аллелей с более высоким числом повторов [384]. Это объясняет выявленные патогене-

тические особенности. При этом показаны межэтнические различия между больными БА при сравнении генов. Частота минорных (мутантных) аллелей и генотипов NOS3 (VNTR), NOS2 (CCTTT)n, GSDMB (rs 2305480), FCER2

(T2206C) оказалась выше у русских больных БА (табл. 62).

213

Таблица 62.Значимые ассоциации полиморфных вариантов генов-

кандидатов с формированием бронхиальной астмы: этнические и гендерные различия

Мы обратили внимание на наличие гендерных различий ассоциаций ге-

нов-кандидатов с развитием бронхиальной астмы в двух этнических группах.

Особенности ассоциаций полиморфных локусов генов-кандидатов с развити-

ем БА у юношей и девушек разной этнической принадлежности, в целом, от-

ражают тот спектр генетических маркеров, который был определен в этих группах (у бурят - ассоциация полиморфизмов генов rs7216389 GSDMB и NOS

(VNTR) с развитие БА; у русских - rs7216389 GSDMB, NOS2А (CCTTT)n и rs16969968 CHRNA5) [19] (табл.64). Однако имеются и различия. Так, у деву-

шек бурят выявлена значимая ассоциация гена провоспалительного цитокина

TNFA (-308G>A) с формированием БА, у русских девушек - гена NOS3

(VNTR), которые при оценке исследуемых этнических групп в целом не опре-

214

делялись. При этом важно, что у девушек обеих этногрупп определено больше ассоциаций развития БА с генами, чем у юношей (табл. 62). Всё это полно-

стью согласуется с клиническими наблюдениями, свидетельствующими о том,

что 2/3 наследственной предрасположенности к БА передаётся по материн-

ской линии, а девушки и женщины чаще болеют этим заболеванием, чем муж-

чины [24, 25, 27, 34, 68].

Наши результаты также согласуются с двумя исследованиями у детей из Санкт-Петербурга [85] и Китая [339], выявившими ассоциацию аллеля А гена

TNFA (-308G>A) с развитием БА у девочек. Останкова Ю.В., Иващенко Т.Э.,

Келембет Н.А. (2005) предположили, что в женском организме с высокой и циклически изменяющейся концентрацией эстрогенов, происходит изменение продукции TNFα и циклическое колебание абсолютного содержания TNFα, в

том числе и в клетках эпителия дыхательных путей, что может быть пусковым механизмом развития атопической БА, в основе которой, как известно, лежат воспалительные реакции легочного эпителия.

Известно, что в подростковом возрасте, в основном у юношей, достига-

ется длительная ремиссии астмы [2, 44, 46, 56, 63, 81, 114, 378]. Данных о ге-

нетических факторах, влияющих на сохранение ремиссии или симптомов аст-

мы в периоде полового созревания, в настоящее время недостаточно. Клини-

ческие наблюдения и популяционные когортные исследования показали, что тяжесть заболевания и частота симптомов астмы являются одними из предик-

торов сохранения болезни, возникшей в детстве, и её перехода в БА взрослых

[27, 229, 308]. По данным когортного исследования, проведенного Hancox R.J., Subbarao P., Sears M.R. (2012) женский пол, атопия, гиперреактивность брон-

хов и активное курение являются факторами риска для сохранения и продол-

жения БА во взрослом возрасте [204]. Стойкие хрипы часто ассоциируются со снижением показателей функции внешнего дыхания, и это прослеживается с раннего детства и связанно с постоянным воспалением и гиперреактивностью бронхов. Хрипящее дыхание, возникшее в раннем возрасте, может быть вре-

менным, и связанным с вирусной инфекцией. Влияние грудного вскармлива-

ния дискутируется и остается спорным [80].

215

Guerra S., Graves P.E., Morgan W.J. et al. (2005) провели когортное ис-

следование среди 168 детей со свистящим дыханием в препубертатном воз-

расте, 85 из них (50,6%) испытали эпизоды свистящего дыхания после наступ-

ления половой зрелости (группа со стойкими хрипами). В 6, 11, 16 лет детям измеряли рост, вес, проводили кожные пробы, собирали анамнез у родителей.

Установлены гендерные различия. Мальчики с гомозиготным генотипом

Gly16/Gly16 гена ADRB2 в два раза чаще демонстрировали стойкие хрипы по-

сле наступления половой зрелости, чем с гетерозиготным генотипом

(ОР=2,17; 95%ДИ [1,4-3,4], р=0,0003), в том числе у европеоидов (ОР=2,48;

95%ДИ [1,4-4,4], р=0,0007); у девочек таких различий не выявлено. Связь между Gly16 и персистирующей астмой после наступления половой зрелости не зависила от частоты хрипящего дыхания и ожирения в препубертатном пе-

риоде. Также не установлено ассоциации полиморфизма Gln27Glu гена

ADRB2 с сохранением астмы в подростковом возрасте [199].

Гендерные различия также могут быть обусловлены функциональным регулированием адренергических рецепторов стероидными и половыми гор-

монами. У девушек в лютеиновую фазу менструального цикла увеличивается плотность β2-АР, введение экзогенного прогестерона в фолликулиновую фазу вызывает снижение плотности β2-АР и ответа цАМФ, приводя к парадоксаль-

ному снижению регуляции β2-АР у девушек с БА, что может проявляться

«предменструальной астмой» [361].

Увеличение калибра дыхательных путей (в связи с интенсивным ростом и увеличением массы тела в подростковом возрасте) могут иметь более пози-

тивное влияние на течение астмы у мальчиков, в отличие от девочек, так как у мальчиков в детском возрасте дыхательные пути более узкие вплоть до пу-

бертатного периода [80, 208, 284]. Рост дыхательных путей относительно ле-

гочных объемов (максимальной скорости выдоха и остаточного объема) быст-

рее происходит у подростков мальчиков, чем у девочек.

Таким образом, выявленные гендерные различия могут быть связаны с особенностями гормональной перестройки и регуляции в подростковом воз-

расте, спецификой воспалительных реакций и патогенеза, подтверждая дан-

216

ные о том, что одним из внутренних (врожденных) факторов риска возникно-

вения БА являются половые различия [80]. С наступлением периода полового созревания и в дальнейшем БА встречается у девушек чаще, чем у юношей.

Хотя значимых гендерных различий в частоте распространенности АПС и за-

болевания в исследованных нами возрастных интервалах у подростков нами не установлено, однако наличие генетических различий доказано. Можно предположить, что ассоциации генов с развитием БА выявленных у девушек,

способствуют продолжению у них БА во взрослом возрасте.

При анализе ассоциаций изучаемых генов-кандидатов с клинико-

лабораторными показателями нами выявлены следующие этнические разли-

чия.

Показано, что возраст начала первых клинических проявлений БА (до 6

лет) имеет этнические различия и зависит от носительства аллеля rs7216389*С

гена GSDMB у бурят и аллеля 9.3 гена THOI (STR) у русских.

По данным когортного исследования в 5 европейских (Исландия, Ни-

дерланды, Великобритания, Германия, Австралия) и одной азиатской (Корея)

стране показана ассоциация аллеля rs7216389*Т гена GSDMB с ранним нача-

лом (до 5 лет) и с тяжестью заболевания [203]. Определена ассоциация с ран-

ним началом БА (до 6 лет) гомозиготного генотипа rs7216389*ТТ гена

GSDMB [366]. Полученные нами различия в ассоциации с ранним началом (до

6 лет) аллеля rs7216389*С соотносятся с этими данными литературы послед-

них лет о популяционных различиях между европеоидами разных стран и ази-

атами (корейцами).

Ассоциация с повышенным уровнем IgE установлена нами только у рус-

ских больных БА по двум исследованным генам: минорному аллелю C гена

FCER2 (T2206C) и аллелями и генотипами, содержащих короткие тандемные повторы (≤9) гена THOI (STR).

Это согласуется с данными литературы об ассоциации трех однонуклео-

тидных полиморфизмов гена FCER2 с повышенным уровнем сывороточного

IgE в течение 4 летней терапии будесонидом (400 мкг/сут) у американских де-

217

тей европейского происхождения (p<0,05) [363]. У лиц с риском повторных обострений астмы уровень IgE повышен на 1,8 раза [330].

Данных литературы по исследованию ассоциаций микросателита гена

THOI с возрастом манифестации БА и повышенным уровнем IgE в сыворотке крови нет, т.к. такие исследования ранее никем не проводились. Выявленная нами его ассоциация у русских пациентов с ранней манифестацией и повы-

шенным уровнем IgE в сыворотке крови вероятно связана с нарушенной регу-

ляцией синтеза катехоламинов.

Ассоциаций исследованных генов в двух популяциях со степенью тяже-

сти заболевания не выявлено.

Оценка контроля бронхиальной астмы базируется на трех фенотипах – частоте обострений, наличии симптомов и изменении функции легких. Гене-

тические и фенотипические предикторы недостаточного ответа на терапию астмы ИГКС различаются по связи с частотой обострений и степенью измене-

ния функции внешнего дыхания [280].

Таким образом, полученные межэтнические различия ассоциаций изуча-

емых генов-кандидатов с формированием БА, с ранней манифестацией забо-

левания, повышенным уровнем IgE могут обусловливать различия в регуля-

ции иммунных механизмов, играющих роль в патогенезе БА и необходимые в будущем для своевременной верификации диагноза и назначения индивидуа-

лизированной противовоспалительной базисной терапии.

Моделирование межгенных взаимодействий у больных бронхиальной астмой бурят и русских, проживающих в Забайкальском крае.

Анализ ассоциаций отдельных генов-кандидатов (локусов) бронхиаль-

ной астмы, не дает достаточно полного представления о механизмах форми-

рования наследственной предрасположенности, так как в основе возникнове-

ния мультифакторианой патологии лежат сложные межгенные и ген-средовые взаимодействия, которые необходимо учитывать при прогнозировании риска развития заболевания и разработки профилактических мероприятий. Поэтому далее проанализированы межгенные взаимодействия парных генотипов (двух-

локусные модели) и мультилокусные модели с помошью MDR и GMDR.

218

Установлены этнические различия в построении мультилокусных моде-

лей межгенных взаимодействий у больных, предрасполагающих к развитию бронхиальной астмы [20]. Наиболее значимыми оказались:

- у бурят трехлокусная модель с участием генов: GSDMB (rs7216389) х

CHRNA5 (rs16969968) х FCER (T2206C);

- у русских – четырехлокусная модель GSDMB (rs7216389) х CHRNA5

(rs16969968) х NOS2A (CCTTT)n х TNFA (-308G>A).

Также выявлены гендерные различия при построении моделей межген-

ных взаимодействий, предрасполагающих к развитию бронхиальной астмы: у

девушек бурят высоко значимыми оказались гены GSDMB (rs7216389) х

GSDMB (rs2305480) х ADRB2 (Arg16Gly) х CHRNA5 (rs16969968); у русских юношей - THОI (STR) х CHRNA5 (rs16969968); у русских девушек - FCER2

(T2206C) х CHRNA5 (rs16969968).

При анализе межгенных взаимодействий парных генотипов в двухло-

кусных сочетаниях у бурят выявлена 21 такая ассоциация генотипов повы-

шенного риска развития БА (ОР: 1,84-13,24), у русских - 19 (ОР=2,16-11,11).

Для сравнения двухлокусных сочетаний генотипов у русских и бурят с БА рассчитано отношение относительных рисков. Установлено, что к формиро-

ванию бронхиальной астмы у русских подростков чаще приводило сочетание двухлокусных генотипов GSDMB rs7216389*TT – CHRNA5 rs16969968*GG,

GSDMB rs7216389*TT – NOS2A (CCTTT)n*SL, GSDMB rs7216389*TT – ADRB

(Gln27Glu)*CC, а у бурят - TNFA (-308G>A)*GG – NOS3 (VNTR)*5/4.

Таким образом, проведенный анализ межгенных взаимодействий дал возможность установить ДНК-локусы исследованных генов, взаимодействую-

щие при формировании наследственной предрасположенности к БА в двух разных этнических группах. Полученные результаты анализа межгенных взаи-

модействий свидетельствуют, что ключевая роль в формировании предрас-

положенности к БА (из числа изученных) у бурят принадлежит полиморфизму rs7216389 гена гасдермина В, у русских - rs16969968 гена ацетил-холинового никотинового рецептора CHRNA5.

219

При сравнительном анализе двух методов изучения межгенных взаимодействий установлено больше парных генотипов повышенного или пониженного риска формирования БА (у бурят - 21 парных сочетания повышенного риска и 18 пониженного риска; у русских - соответственно 19 и

18) при использовании анализа попарных комбинаций (двухлокусных)

генотипов. Тогда как, при определении методом редукции мультифакторных пространств (MDR, GMDR) двухлокусных моделей выявлялось значительно меньше. Сопоставимыми по двум методам определения межгенных взаимодействий являлись лишь два сочетания попарных генотипов у русских больных БА и три попарных сочетания генотипов у бурят [20]. В то же время,

преимуществом метода редукции мультифакторных пространств является оценка значимости мультилокусных моделей, включающих три и более взаимодействующих локусов генов.

Анализ позволил установить сложный характер взаимодействий между генами-кандидатами развития БА и генами предрасположенности к табакоку-

рению и возможные патогенетические различия воздействия внешне-средовых факторов риска в формировании БА у представителей разных этносов.

Проведена оценка вклада каждого из исследуемых генов и выявлены особен-

ности взаимодействия исследованных полиморфных локусов при развитии заболеваний.

Анализ сочетанного воздействия генетических и средовых факторов предрасполагающих к бронхиальной астме (с учётом межгенных взаимодей-

ствий).

Анализ взаимодействий генов-кандидатов предрасположенности к БА и к табакокурению с внешне-средовой экспозицией к табачному дыму прово-

дился методом сопоставления величин отношения шансов (ОШ) по наличию

(ОШ f+) или отсутствию (ОШ f-) фактора риска.

Бронхиальная астма у курящих больных ассоциирована с генами

GSDMB (rs7216389), NOS3 (VNTR) и ADRB2 (Gln27Glu), у некурящих – с ге-

нами GSDMB (rs7216389), CHRNA5 (rs16969968) и ADRB2 (Gln27Glu).

220

Выявлены аллели и генотипы Т и гомозиготного генотипа T/T полимор-

физма rs7216389 GSDMB повышенного риска формирования БА, одинаковые для курящих и некурящих больных.

Маркерами повышенного риска заболевания БА является носительство -

укурящих:

–генотипов 4/4 или 4/5 гена NOS3 (VNTR);

–генотипов GG или CG гена ADRB2 (Gln27Glu);

унекурящих:

–генотипа CC гена ADRB2 (Gln27Glu);

–аллеля G и генотипа G/G гена CHRNA5 (rs16969968);

–аллелей и генотипов, содержащие короткие повторы с числом 6-9, гена TH0I

(STR).

На первый взгляд кажется, что у некурящих больше генов ассоциировано с заболеванием, в том числе и двух генов-кандидатов предрасположенности к табачной зависимости. Однако у курящих выявлена ассоциация мутантных

(минорных) генотипов 4/4 или 4/5 гена NOS3 (VNTR), генотипов GG или CG

гена ADRB2 (Gln27Glu) и T/T полиморфизма rs7216389 GSDMB с повышенным риском развития заболевания. У некурящих выявлена ассоциация носительства минорного генотипа T/T полиморфизма rs7216389 GSDMB, аллелей и геноти-

пов, содержащих короткие повторы (6-9) гена TH0I (STR), а также носитель-

ства «дикого» генотипа CC гена ADRB2 (Gln27Glu), аллеля G и генотипа G/G

гена CHRNA5 (rs16969968) с повышенным риском развития БА.

Из генов предрасположенности к никотиновой зависимости у курящих больных в ген-средовых взаимодействиях участвовал ген тирозингидроксила-

зы (TH0I), причем он синергично связан с геном ADRB (Gln27Glu). Роль гена

TH0I не случайна, так как тирозингидроксилаза является основным фермен-

том синтеза катехоламинов, который переводит тирозин в ДОФА (Тирозин → ДОФА → Дофамин → Норадреналин → Адреналин) [136]. Транскрипция фермента тирозингидроксилазы активируется ацетилхолином, действующим через никотиновые холинергические рецепторы, которые имеются также в