диссертации / 5

2

СОДЕРЖАНИЕ

Раздел I. ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………….. 5

Раздел II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 2.1. Молекулярная фармакология глюкокортикоидов: механизмы

преобразования гормонального сигнала в биологический ответ клеток-

мишеней……………………………..…………………………………………10

Глава 2.2. Методы модификации лекарственных средств на наноуровне

…………………………………………………………………. . . . . . . . . . . ..20

Глава 2.3. Эволюция топических глюкокортикоидов, применяемых в

дерматологии ……………………………………………………………… . 34

Раздел III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………… 42

Раздел IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 4.1. Идентификация и изучение свойств специфических «систем узнавания», локализованных на плазматических мембранах фибробластов кожи …………………………………….…………………………………….57

Глава 4.2. Определение молекулярных мишеней апоптотического

активности фибробластов кожи . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

Раздел V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ. . . . . . . . . . . . . 77

ВЫВОДЫ……………………………………………………………… . . …91

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………... . . 92

3

Кд - равновесная константа диссоциации КМ – кальмодулин ЛС - лекарственное средство мРНК - матричная РНК

НР-ГК - наноразмерный кортизол-полимерный комплекс ПВП - поливинилпирролидон ПГ - простагландин ПК – протеинкиназа

ПМ - плазматическая мембрана ПНФ - пуриннуклеозидфосфорилаза

ПФЗ – потенциалчувствительные флуоресцентные зонды ПЭГК - полиэтиленгликоль РНК - рибонуклеиновая кислота

СКК - стволовая кроветворная клетка СТГ – соматотропный гормон

Т3 - трийодтиронин ТМП – трансмембранный потенциал ТФП – трифлуоперазин

ТХУ - трихлоруксусная кислота ФИА - фенилизопропиладенозин

4

ФИФ2 – фосфатидилинозитолдифосфат ФД – фармакодинамика

ФК – фармакокинетика фл – фемтолитры (10-15 литра) Фл – фосфолипиды Фл А2 – фосфолипаза А2 Фл С – фосфолипаза С

ФМА – форболмеристатацетат Фн - неорганический фосфат

ФНО – фактор некроза опухоли альфа цАМФ - аденозин 3',5'-циклический монофосфат

цГМФ – гуанозин-3,5-циклический монофосфатм – митохондриальный трансмембранный потенциал

п – плазматический трансмембранный потенциал [Ca2+]цит – внутриклеточная концентрация ионов кальция Bmax - концентрация участков связывания лиганда DMPX - диметилпропаргилксантин

Gi - ингибирующий ГТФ-связывающий белок Gs - стимулирующий ГТФ-связывающий белок

Gt - трансдуцин

G-белки - ГТФ-связывающие белки TNF- - фактор некроза опухоли-гамма Vкл – объем клетки

Раздел I. ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования

В настоящее время топические стероиды активно применяются при лечении различных воспалительных и аллергических заболеваний кожи - атопического,

контактного аллергического дерматитов, псориаза и других дерматозов.

Использование гидрокортизона, первого препаратa в данной группе, в

дерматологической практике выявило недостаточную его эффективность при тяжелых и хронических процессах [Шимановский Н.Л., 2005; Gessi S. еt al.,

2010]. Поиск препаратов, имеющих более выраженный

противовоспалительный эффект привел к созданию галогенизированных

психозоподобные реакции и т.д.). Ранее считали, что противовоспалительный,

противоаллергический, десенсибилизирующий, антитоксический и

иммунодепрессивный эффекты стероидов реализуются через один рецептор и поэтому неотделимы друг от друга [Cidlowski JA. et al., 1998]. Однако использование современных инновационных технологий открывает новые возможности в этом направлении, в частности применение нанотехнологий для разделения фармакологических эффектов глюкокортикоидных препаратов

[Labeur M. et al., 2010]. Заданное изменение свойств лекарственных веществ с

помощью нанотехнологического подхода включает два основных способа

[Шимановский Н.Л. и др., 2010]. Первый подход - синтез лекарственных соединений, имеющих наноразмеры на основе полимерной модификации лекарственных веществ (конъюгация молекулы лекарственного вещества и полимера) [Wang, Y.S., 2002]. Второй - включение лекарственного вещества в состав наноматериалов представленных мицеллами, дендромерами, сферами

(фуллерены) [Boas U. et al., 2004]. Так, конъюгация лекарственного вещества с полиэтиленгликолем или пэгилирование (ПЭГК) увеличивает растворимость лекарственного вещества за счет собственной гидрофильности, увеличивает

размер и массу частицы, снижая, таким образом, интенсивность почечной экскреции. ПЭГК уменьшает доступность лекарственного вещества для протеолитических ферментов и антител. Примеры препаратов такого рода,

одобренных FDА: ПЭГ-аспарагиназа (Oncaspar®), предназначенная для лечения острой лимфоцитарного лейкоза и других лимфоидных опухолевых заболеваний; ПЭГ-аденозина деаминаза (Adagen®), для лечения тяжелых комбинированных иммунодефицитов.

В настоящее время ведутся разработки по модификации различных лекарственных веществ с помощью дендримеров. Наиболее интенсивно разрабатываются модификации следующих классов лекарственных веществ:

НПВС, противомикробные и противовирусные препараты, противоопухолевые средства (цитостатики, радионуклиды, фоточувствительные соединения), что объяснимо не только особенностями их физико-химических свойств, но и

эпидемиологической значимостью соответствующих патологий.

Одной из новых возможностей, связанной с получением синтетических

структур глюкокортикоидов наноразмеров (наностероидов), является изучение

молекулярных механизмов ранних, мембранотропных эффектов глюкокортикоидов на клетки-мишени. За последние годы появились серии

публикаций, описывающих быстрые экстрагеномные мембранотропные

эффекты стероидов [Stahn C. et al., 2008; Löwenberg M. et al., 2008; Revollo JR,

Cidlowski JA, 2009]. К ним можно отнести инотропное и вазоконстрикторное действие альдостерона, быстрые нейрональные эффекты прогестерона, ранние эффекты витамина Д3 на уровень кальция и цАМФ в клетках костной ткани.

аденилатциклазы, протеинкиназы С, 5'-нуклеотидазы в норме и при опухолевом росте [Dindia L. et al., 2012]. Ранее было показано, что повысить тропность стероидных гормонов к плазматическим мембранам и модифицировать их генотропную активность можно с помощью

комплексирования с полимерными материалами, в частности с поливинилпирролидоном [Духанин А.С. и др., 2003]. Комплекс поливинилпирролидон– глюкокортикоид, не проникая в клетку, способен через мембранные структуры усиливать эффекты (пермиссивное действие)

адреномиметиков (изадрина), и свободного глюкокортикоида на модели тимоцитов крыс – повышать уровень цАМФ и цитостатическую активность глюкокортикоидов. Создание комплексов, не проникающих в клетку, но потенцирующих, например, эффекты адреномиметиков и антиаллергических средств может позволить создать новые антиаллергические,

противовоспалительные средства с избирательным типом действия.

Цель исследования

Целью данной работы было определение фармако-биохимических особенностей действия на фибробласты мономерных глюкортикоидов и наноразмерного кортизол-полимерного комплекса.

В качестве объекта исследования были выбраны фибробласты кожи – клетки-

мишени фармакологического действия глюкокортикоидов, участвующие в воспалительных и аллергических реакциях при дерматозах.

Задачи исследования

1)Разработка экспериментальной модели для изучения геномных и негеномных эффектов глюкокортикоидов с использованием культуры клеток фибробластов.

2)Определение фармако-биохимических маркеров начальных этапов апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами.

3)Сравнительное исследование геномного и негеномного действия глюкокортикоидов на фибробласты с помощью наноразмерного кортизол-полимерного комплекса.

4)Изучение молекулярных механизмов влияния наноразмерного кортизол-

полимерного комплекса на обмен вторичных мессенджеров в культуре фибробластов кожи .

Научная новизна

Впервые показано, что ранние этапы апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами, включают изменение внутриклеточного гомеостаза,

которые определяются уменьшением pH цитоплазмы и увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Молекулярными мишенями действия глюкокортикоидов являются Na/H-обменник и Са-каналы плазматических мембран фибробластов.

Впервые показано, что величина внутриклеточного рН может служить ранним дифференциальным маркером апоптотической и некротической форм гибели фибробластов.

Впервые установлено, что в терапевтической области концентраций кортизол подавляет кальциевый ответ фибробластов на ангиотензин II (АII). В

физиологическом диапазоне концентраций кортизол потенцирует действие АII,

его эффект опосредован взаимодействием с мембранными рецепторами минералкортикоидов.

Практическая значимость

Предложен новый подход для изучения молекулярных механизмов ранних,

мембранотропных эффектов глюкокортикоидов на клетки-мишени,

основанный на использовании наноразмерных глюкокортикоидов.

Применение наноразмерного кортизол-полимерного комплекса позволяет избирательно регулировать функциональную активность фибробластов на уровне мембранной рецепторной системы, что открывает новые предпосылки дальнейшей эволюции топических глюкокортикоидов, применяемых в дерматологии, с помощью наноразмерного дизайна оригинальных молекулярных комплексов - разделение терапевтического и побочных эффектов гормонотерапии.

Положения выносимые на защиту

1. Ранние этапы апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами, включают изменение внутриклеточного гомеостаза,

которые определяются уменьшением pH цитоплазмы и увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Молекулярными мишенями действия глюкокортикоидов являются Na/H-обменник и Са-каналы плазматических мембран фибробластов.

2. Использование наноразмерного кортизол-полимерного комплекса позволяет разделить геномные и негеномные механизмы регуляции активности клетки-

мишени.

3. Выявлены два типа экстрагеномного влияния глюкокортикоидов на фибробласты: 1) потенцирующее действие ГК на эффект AII, реализуемое через минералкортикоидные рецепторы; 2) антагонистический мембранотропный глюкокортикоидов, выявляемый при использовании фармакологических концентраций стероидов.

Внедрение результатов исследования

Результаты настоящего исследования используются в учебной работе кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.Сепгеева РНИМУ им. Н.И.Пирогова г.Москвы.

Апробация

Основные положения диссертации доложены на 7-ой международной научно-

практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», май 2010 г., Астрахань; на совместной научной конференции кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии и НИЛ молекулярной фармакологии РНИМУ им Н.И.Пирогова.

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в том числе

3 работы в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Раздел II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 2.1. Молекулярная фармакология глюкокортикоидов: механизмы преобразования гормонального сигнала в биологический ответ клетокмишеней.

Согласно классической «двухступенчатой» модели, рецепторный цикл состоит из нескольких этапов (рис. 1).

Проникновение стероидов в клетку и связывание с внутриклеточными

(цитозольными или ядерными) рецепторами ГК, представляющими минорную фракцию протеинов (10-12 от общего количества клеточного белка) [Vig E et al.,

1994].

Трансформация гормон-рецепторного комплекса в активную форму.

Активация, возможно, осуществляется за счет фосфорилирования in vivo

рецепторного белка с использованием АТФ в качестве субстрата [Tang Y,

DeFranco DB, 1996].

Взаимодействие комплекса "гормон-рецептор" с акцепторными сайтами

вхроматине. После связывания освободившийся рецептор покидает ядро и возвращается в цитоплазму клетки [Голиков П.П., 1988, 2002]. Таким образом,

биологическая роль рецепторов цитоплазмы сводится к захвату, первичной аккумуляции и доставке гормона в ядро.

Биохимические свойства внутриклеточных рецепторов глюкокортикоидов.

Рецепторы глюкокортикоидов (РГ) были первыми рецепторами стероидных гормонов, обнаруженными в различных тканях [Beato M., 1989]; предполагают,

что они имеются в подавляющем большинстве органов и тканей [Розен В.Б., 1985, 1990]. Доказано наличие специфических рецепторов к ГК в коже,

легочной ткани, печени и других органах.

Внутриклеточные рецепторы глюкокортикоидных гормонов представляют собой ядерные факторы транскрипции, которые относятся к суперсемейству рецепторов стероидных гормонов/тиреоидных гормонов/ретиноидов/витамина Д3. Они состоят из одной полипептидной цепи (рис. 2), содержащей около 700

аминокислотных остатков, в их третичной