при взаимодействии комплекса антиген – антитело. Результат регистрируется невооруженным глазом по характеру сформировавшегося осадка.

РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:

-обнаруживать антитела и определять их титр в сыворотках

крови;

-обнаруживать и идентифицировать антиген (прежде всего вирусный).

Для постановки РНГА необходимы определенные компоненты:

1.Известные «эритроцитарный антигенный диагностикум»

и«антительный (иммуноглобулиновый) эритроцитарный диагностикум».

2.Исследуемая (неизвестная) сыворотка крови животных или человека.

3.Нормальная сыворотка крови (для контроля).

4.Исследуемый (неизвестный вируссодержащий или бактериальный) материал.

5.Нормальный физиологический раствор, содержащий 1% кроличьей сыворотки крови для разведения компонентов реакции.

6.Заведомо положительная сыворотка крови (содержит известные противовирусные или антибактериальные антитела) для контроля.

7.Эритроциты нормальные для контроля.

3 МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РНГА

3.1 Приготовления сенсибилизированных эритроцитов

Процесс приготовления сенсибилизированных эритроцитов (эритроцитарного диагностикума) состоит из нескольких стадий:

1. Подготовка эритроцитов. Для этой цели широко применяют эритроциты барана или человека. В настоящее время часто используют эритроциты белых мышей и некоторых птиц (кур, уток, индеек) - они быстрее оседают, что позволяет

6

сократить сроки исследования без потери чувствительности. У животных (птиц) берут кровь, дефибринируют ее и трижды отмывают изотоническим раствором при центрифугировании.

2.Фиксация эритроцитов. Для фиксации эритроцитов используют формальдегид, глутаровый или акриловый альдегиды. 50 %-ную взвесь отмытых эритроцитов соединяют с равным объемом 50%-ого формалина и после двухчасового контакта при 37оС с периодическим встряхиванием эритроциты отмывают 3 раза. Преимущество фиксированных эритроцитов в том, что они могут быть заготовлены впрок и длительное время храниться в суспензии.

3.Танизация эритроцитов. Несмотря на то, что механизм действия танина на эритроциты мало изучен, при этом достигается главное – танизированные эритроциты обладают значительно большей сорбирующей способностью (сорбционной емкостью белков). Танизация осуществляется путем смешивания равных объемов 3%-ной взвеси эритроцитов и раствора танина в концентрации 1:20000. После 10–15-минутного контакта при 37оС смесь центрифугируют, а осадок трехкратно промывают фосфатным буфером.

4.Сенсибилизация эритроцитов. 10%-ную концентрацию эритроцитов на 0,15 М фосфатном буфере смешивают с равным объемом вируссодержащей жидкости. Смесь выдерживают 60 минут при 37оС, периодически встряхивая, затем центрифугируют и 2-3 раза отмывают. Осадок сенсибилизированных эритроцитов разводят до 1%-ной концентрации в фосфатном буферном растворе, содержащем 1% нормальной кроличьей сыворотки.

3.2 Главный опыт РНГА

Реакцию ставят в пробирках или в лунках плексигласовых панелей. Существует два метода постановки РНГА: макрометод и микрометод. В последнее время чаще пользуются микрометодом.

7

Методика и последовательность постановки РНГА для обнаружения антител (противовирусных) и определения их

сыворотки крови, предварительно обработанной с целью удаления ингибиторов прогреванием (58–60оС в течение 30 мин), начиная с 1:10 до 1:1280. Для разведения используют физиологический раствор, содержащий 1% нормальной сыворотки крови кролика; рН 7,2…7,4. Объем каждого разведения 0,2 мл.

2.К каждому разведению сыворотки крови добавляют по 0,2 мл эритроцитарного антигена (вирусного), смесь встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2-3 часа.

3.Результаты реакции учитывают по наличию или отсутствию осадка эритроцитов на дне пробирки (лунки). При положительном значении реакции осадок склеенных эритроцитов напоминает тонкую пленку или раскрытый перевернутый зонтик, при отрицательном – плотный осадок в виде маленького диска или колечка.

За титр антител в исследуемой сыворотки крови принимают наибольшее ее разведение, вызывающее агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов.

4.Одновременно обязательно ставят контроли:

-с сенсибилизированнными эритроцитами и физиологическим раствором на спонтанную агглютинацию эритроцитарного антигена (реакция отрицательная);

-с исследуемой сывороткой крови и несенсибилизированными (нормальными) эритроцитами на отсутствие в сыворотке крови неспецифических гемагглютининов (реакция отрицательная);

-с сенсибилизированнными эритроцитами и положительной сывороткой крови, содержащей специфические антитела, на активность сенсибилизированных эритроцитов (реакция положительная);

-с сенсибилизированнными эритроцитами и нормальной сывороткой крови, не содержащей специфические антитела, на специфичность сенсибилизированных эритроцитов (реакция отрицательная).

8