Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в клинической лабораторной диагностике. Общие принципы Методические рекомендации

явления нескольких возбудителей. Часто применяется также для проведения ПЦР с внутренним контролем.

«Гнездовая» ПЦР. Используется для детекции малых количеств ДНК (1-100 копий на пробу). Праймеры подбираются таким образом, чтобы места их гибридизации во втором раунде ПЦР находились внутри участка ДНК, ограниченного праймерами для первого раунда ПЦР. При таком проведении ПЦР ДНК, синтезируемая в первом раунде, служит матрицей для второго раунда реакции. ПЦР в два раунда позволяет добиться повышения чувствительности реакции, за счет увеличения числа циклов ПЦР, и повышения специфичности, за счет использования комбинации из четырех праймеров. Следует отметить, однако, что при использовании ПЦР в два раунда повышается вероятность контаминации между исследуемыми образцами.

ПЦР с горячим стартом. Применяется для уменьшения неспецифического отжига праймеров в ходе приготовления реакционной смеси при комнатной температуре. Для предотвращения преждевременного взаимодействия фермента с компонентами реакционной смеси и, как следствие, образования неспецифических продуктов реакции до момента полного прогрева, используется легкоплавкий парафин или специальные масла, отделяющие полимеразу от реакционной смеси. Описаны методы, в которых между компонентами создают механическую преграду (например, восковую). После нагревания преграда расплавляется и компоненты смешиваются. Альтернативным подходом является использование химически модифицированных ДНК-полимераз или полимераз, связанных с моноклональными антителами. Прогрев реакционной смеси, содержащий такие ДНКполимеразы, при повышенной температуре приводит к их активации.

Ступенчатая ПЦР. Вариант характеризуется плавным снижением температуры отжига праймеров. Применяется для повышения специфичности реакции. В первых циклах ПЦР температура отжига праймеров превышает расчетную, что снижает вероятность неспецифического отжига праймеров. Последовательное снижение температуры отжига праймеров в каждом цикле приводит к увеличению доли специфического фрагмента ПЦР.

ПЦР длинных фрагментов. Вариант ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Для реализации данного подхода используют смесь двух полимераз, одна из которых – Taq-полимераза с высокой процессивностью (способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая – ДНК-полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью (Pfu-полимераза). Она необходима для корректирования ошибок, внесённых Taq-полимеразой, при этом некомплементарные нуклеотиды удаляются с помощью Pfu-полимеразы.

In situ ПЦР. Проводится в образцах тканей, фиксированных на предметном стекле. Позволяет изучать процессы внутриклеточного размножения и развития вирусов, экспрессии генов в различных клетках ткани. Регистрация результатов реакции обычно проводится методом гибридизации с использованием флуоресцентных меток.

ПЦР в реальном времени. Используется для одновременной амплификации и детекции искомой молекулы ДНК. Позволяет судить как о присутствии искомой ДНК, так и оценить ее изначальное количество за счет регистрации накоп-

10

ления продуктов амплификации в реальном времени после каждого цикла амплификации. По сути, является одним из способов детекции продуктов амплификации. Более подробное описание приводится в главе «Этапы анализа клинического материала с использованием ПЦР». Ввиду относительной простоты исполнения, низкого риска контаминации и возможности количественного определения ПЦР в реальном времени нашла исключительно широкое применение в клинической лабораторной диагностике.

Другие методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК)

Разработка метода ПЦР явилась поворотным событием в развитии молекулярной диагностики. Хотя этот метод амплификации нуклеиновых кислот остается наиболее распространенным, в настоящее время предложены и другие методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК).

МАНК можно разделить на методы амплификации ДНК и методы амплификации РНК. К методам амплификации ДНК, кроме ПЦР, относится амплифика-

ция со смещением нити ДНК (strand displacement amplification, SDA), к методам амплификации РНК – транскрипционно-опосредованная амплификация

(transcription mediated amplification, TMA), амплификация, основанная на по-

следовательности нуклеиновых кислот (nucleic acid sequence-based amplification,

NASBA) (рис. 4).

кации нуклеиновых кислот

Рис. 4. Методы анализа нуклеиновых кислот

Метод SDA основан на изотермической амплификации ДНК, осуществляемой с помощью ферментов ДНК-полимеразы и эндонуклеазы рестрикции и позволяет амплифицировать как одноцепочечную, так и двуцепочечную ДНК. Разработаны международные тесты на основе SDA для диагностики гонореи, хламидийной инфекции.

11

Из методов амплификации РНК в диагностике инфекций наиболее широкое применение получили методы TMA и NASBA. Оба метода являются изотермическими; в их основу легли процессы, происходящие при репликации ретровирусов, с использованием ферментов обратной транскриптазы, РНК-азы Н и РНК-полимеразы фага Т7. При начальном количестве 10-100 копий РНКмишени в результате реакции может генерироваться до 1014 копий РНКпродукта. Различия между TMA и NASBA заключаются в том, что в тестах на основе TMA используется обратная транскриптаза с эндогенной РНК-азной активностью, а в тестах на основе NASBA функции обратной транскрипции и гидролиза РНК выполняют разные ферменты.

С помощью методов TMA и NASBA можно амплифицировать различные виды РНК: мРНК, рРНК, а также геномную РНК РНК-содержащих вирусов. Основными областями применения этих методов являются 1) изучение экспрессии генов, 2) диагностика бактериальных и грибковых инфекций, основанная на выявлении 16S рРНК и 18S рРНК, соответственно, 3) диагностика инфекций, вызванных РНК-содержащими вирусами. Разработаны международные тесты на основе ТМА для диагностики гонореи, хламидийной инфекции, трихомониаза, выявления онкогенных типов вируса папилломы человека. Предлагается ряд тестов на основе NASBA для выявления цитомегаловируса, некоторых инфекций, передаваемых половым путем.

МАНК, включая ПЦР, имеют неоспоримые преимущества для диагностики инфекций перед традиционными методами клинической микробиологии. МАНК, при высокой специфичности, обладают очень высокой чувствительностью. При использовании МАНК не требуется сохранения жизнеспособности возбудителя, поэтому они менее требовательны к условиям хранения и транспортировки образцов. МАНК предоставляют возможность тестирования образцов, полученных неинвазивным способом, а также образцов, полученных самим пациентом. МАНК быстры в исполнении, в высокой степени стандартизированы и автоматизированы, имеют высокую пропускную способность.

Применение метода ПЦР в клинической микробиологии

Благодаря своим качествам, изложенным в предыдущей главе, метод ПЦР, а также другие МАНК, очень широко применяются в клинической микробиологии. Основными группами инфекций, для которых ПЦР применяется наиболее широко, являются так называемые социально значимые инфекции, особо опасные и природно-очаговые инфекции, гемотрансмиссивные инфекции, оппортунистические инфекции, перинатальные инфекции.

Диагностика социально значимых инфекций. К социально значимым ин-

фекциям относят туберкулез, ВИЧ-инфекцию, вирусные гепатиты (В и С), инфекции, передаваемые половым путем (ИППП).

ПЦР является основным инструментом прямого выявления возбудителя туберкулеза – трудно культивируемых бактерий Mycobacterium tuberculosis. Также ПЦР используется для типирования этих бактерий, что является важной

12

стороной контроля за распространением инфекции как внутри стационаров, так и внутри определенных географических регионов. Кроме того, с помощью ПЦР можно выявлять генетические детерминанты устойчивости микроорганизма к антимикробным препаратам.

ПЦР используется для прямого выявления возбудителей ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов В и С. Кроме выявления РНК этих вирусов, ПЦР применяют для выявления мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью, а также для выявления полиморфизмов, ассоциированных с ответом на лекарственную терапию. ПЦР также используется для генотипирования вируса гепатита С, отличающегося высокой генетической изменчивостью, что имеет большую актуальность с точки зрения прогноза развития заболевания и тактики ведения пациента.

ПЦР (а также другие МАНК) является незаменимым способом диагностики ИППП. ПЦР – это основной метод диагностики хламидийной инфекции, генитального герпеса, трихомониаза и единственный метод выявления Mycoplasma genitalium. ПЦР широко используется, наряду с культуральным методом, для диагностики гонореи. Этот метод является основным способом прямого выявления возбудителя сифилиса. Благодаря своей высокой чувствительности ПЦР позволяет выявлять возбудителя даже при минимальном его содержании. Это особенно актуально при бессимптомном течении инфекционного процесса, что является не редким для ИППП.

Диагностика особо опасных и природно-очаговых инфекций. Особо опасные инфекции – острые инфекционные болезни человека, способные к внезапному появлению, быстрому распространению и характеризующиеся тяжёлым течением и высокой летальностью. Природно-очаговые инфекции – это инфекционные болезни, имеющие резервуары поддержания (очаги) возбудителя в дикой природе; склонны к вспышкам, у людей нередко протекают в тяжелой форме, характеризуются относительно высокой летальностью и требуют систематического мониторинга природных очагов. ПЦР применяется для выявления возбудителей клещевых инфекций (иксодовый клещевой боррелиоз, клещевой энцефалит, гранулоцитарный анаплазмоз, моноцитарный эрлихиоз), холеры, сибирской язвы, чумы, бруцеллеза, лептоспироза, ку-лихорадки (коксиеллеза), лихорадки Денге, лихорадки Западного Нила, геморрагической лихорадки Крым-Конго и некоторых других.

Диагностика гемотрансмиссивных инфекций. Метод ПЦР широко ис-

пользуется в службах крови для выявления наиболее трансфузионно-опасных вирусов – ВИЧ, вирусов гепатитов В, С, А, парвовируса и других. Опыт применения тестирования крови на эти вирусы показал его эффективность при выявлении доноров вирусоносителей, особенно в серонегативном периоде, и с июля 1999 года в странах Европейского союза генотестирование стало обязательным для всей донорской крови и плазмы. Метод ПЦР решает следующие задачи службы крови:

обеспечение инфекционной безопасности в период «серонегативного окна»;

обеспечение информацией об отсутствии инфекционных агентов в крови или ее компонентах при неопределенных результатах обычного иммуноферментного анализа;

13

обеспечение выявления истинных вирусоносителей среди серопозитивных

лиц;

генотипирование – определение на уровне генома антигенов лейкоцитов и тромбоцитов (HLA, HPA).

Диагностика оппортунистических инфекций. Оппортунистические ин-

фекции – заболевания, вызываемые микроорганизмами и вирусами, которые обычно не приводят к болезни у здоровых иммунокомпетентных людей. Наиболее распространенными возбудителями являются: вирусы (цитомегаловирус,

вирус Эпштейна–Барр), бактерии (Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanni, Clostridium difficile), грибы (Candida albicans, Aspergillus spp., Pneumocystis jirovecii, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum), простейшие (Toxoplasma gondii, Cryptosporidium spp.). Оппортунистические инфекции имеют тенденцию к диссеминации возбудителя, слабо поддаются специфической терапии, имеют тенденцию к множественным рецидивам. Кроме того, к этим инфекциям развивается слабый специфический иммунный ответ. Так как часто возбудители оппортунистических инфекций являются компонентами нормальной микрофлоры человека, диагностическое значение имеет выявление возбудителя в не свойственных ему локализациях и/или в повышенном количестве.

Диагностика перинатальных инфекций. Перинатальные инфекции – ос-

новная причина заболеваемости и смертности среди новорожденных детей. Как правило, данные инфекции у беременных женщин протекают не тяжелее, чем у небеременных женщин и не представляют большой угрозы здоровью и жизни женщины, однако их последствия для плода и новорожденного могут быть очень тяжелыми. Наиболее часто встречающиеся перинатальные инфекции – цитомегаловирусная инфекция, токсоплазмоз, краснуха, парвовирусная инфекция, ветряная оспа, листериоз. Перинатальные инфекции могут быть обусловлены также возбудителями ИППП. Важнейшей составляющей профилактики перинатальных инфекций является антенатальный скрининг, основой которого являются серологические исследования. Метод ПЦР обычно используется при наличии серологических и/или ультразвуковых признаков инфекции у плода для выявления возбудителя в амниотической жидкости и/или крови плода.

Обеспечение качества лабораторной диагностики, основанной на МАНК

Лабораторные исследования с использованием ПЦР, как и всех других МАНК, отличает определенная сложность и многоэтапность: пробоподготовка и выделение нуклеиновых кислот, амплификация специфического фрагмента нуклеиновой кислоты, детекция амплифицированных продуктов и анализ полученных результатов. При использовании ПЦР, как и в случае любых методов диагностики, существует риск получения как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов, что обусловлено как свойствами МАНК, так и свойствами определяемых аналитов. Так, высокая чувствительность МАНК обусловливает высокий риск получения ложноположительных результатов

14

вследствие контаминации, а присутствие в реакции субстанций, ингибирующих энзиматическую амплификацию, может привести к получению ложноотрицательных результатов. К свойствам аналитов, которые могут приводить к лабораторным ошибкам, относятся высокий уровень гомологии с близкородственными микроорганизмами, частые генетические обмены, а также полиморфизм мишени. Минимизировать риски лабораторных ошибок призвана система обеспечения качества. Часть рисков контролируется в ходе стандартного протокола исследования (риск контаминации, риск ингибирования). Риски, связанные с неоптимальным выбором мишени, а также неоптимальным дизайном праймеров и зондов должны нивелироваться путем надлежащей клинической оценки тестов.

Основными компонентами системы обеспечения аналитического качества диагностики инфекционных заболеваний являются контроль качества и оценка качества (рис. 4). Контроль качества включает процедуры внутреннего контроля качества и контроля качества аналитических систем. Применительно к молекулярной диагностике, к процедурам внутреннего контроля относятся контроль взятия материала, контроль выделения ДНК/РНК, контроль амплификации, контроль ингибирования амплификации, контроль контаминации. Процедуры внутреннего контроля качества должны быть включены в стандартный протокол лабораторного исследования.

Обеспечение качества молекулярной микробиологической диагностики

К мере контроля качества аналитических систем относится, в первую очередь, клиническая оценка тестов. Любой тест, коммерческий или некоммерче-

15

ский, перед внедрением в рутинную диагностику должен пройти надлежащую клиническую оценку. Если предполагается внедрить тест, аналитические и диагностические параметры которого описаны в литературе и соответствуют задачам лаборатории, достаточно провести валидацию теста, например, с использованием панели охарактеризованных образцов биологического материала, как положительных (содержащих разные концентрации возбудителя), так и отрицательных. Если планируется использовать тест, информация об аналитических и диагностических параметрах которого недоступна или была получена для популяций, существенно отличающихся от той, в которой предполагается использовать тест, необходимо провести его клиническую оценку.

Оценка качества диагностики служит для установления точности результатов исследований, а также меж- и внутрилабораторной воспроизводимости, и включает меры внешней и внутренней оценки качества. Лаборатория должна на регулярной основе участвовать в межлабораторных сравнениях, организуемых системами внешней оценки качества, как национальными, так и международными. К процедурам внешней оценки качества относится тестирование зашифрованных контрольных панелей микроорганизмов. Для адекватной оценки чувствительности используемых тестов для выявления облигатных патогенов в состав панели должны быть включены образцы с предельно низким содержанием возбудителя. При создании контрольных панелей необходимо учитывать генетический полиморфизм циркулирующих штаммов анализируемого инфекционного агента, а также степень гомологии нуклеотидных последовательностей тестируемого и близкородственных ему микроорганизмов. В качестве меры внутренней оценки качества может служить периодическое повторное тестирование зашифрованных клинических проб.

В Российской Федерации одним из важнейших элементов системы обеспечения качества клинической лабораторной диагностики является Федеральная система внешней оценки качества клинических лабораторных исследований (ФСВОК), которая функционирует с 1995 года. Согласно Методическими указаниями МУ1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» (Москва, 2012), лаборатория должна принимать участие программах по внешней оценке качества лабораторных исследований (ФСВОК и т.д.) по конкретным нозологическим формам не реже 1 раза в год.

Основными разделами ФСВОК относительно ПЦР являются:

Выявление микобактерий туберкулеза

Молекулярно-генетическое выявление лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза

Выявление вируса гепатита В (HBV)

Выявление HCV

Выявление ВИЧ

Выявление Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum

16

Выявление Neisseria gonorrhoeae

Выявление вируса папилломы человека (ВПЧ)

Количественное определение ДНК вируса гепатита В (ВГВ)

Количественное определение РНК вируса гепатита с (HCV)

Принципы организации работы лаборатории, применяющей МАНК

Устройство лаборатории, осуществляющей исследования с использованием МАНК, в настоящее время регламентируется Методическими указаниями МУ1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» (Москва, 2012). Основные требования к помещениям и оборудованию лаборатории, использующей МАНК, к проведению работ, к защитной одежде, к обработке помещений и обеззараживанию материала суммированы ниже.

Требования к помещениям и оборудованию лаборатории. Лаборатория в соответствии с этапами проведения анализа должна включать следующий набор последовательно расположенных самостоятельных рабочих зон (помещений) или отдельно выделенных рабочих зон в составе других функциональных помещений:

приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала (Рабочая зона 1);

выделения нуклеиновых кислот (Рабочая зона 2 или «чистая» зона);

проведения реакции амплификации и учета ее результатов при использовании гибридизационно-флюоресцентного метода детекции (Рабочая зона 3);

учета результатов реакции амплификации нуклеиновых кислот методом электрофореза и (или) гибридизационно-ферментным методом детекции (Рабочая зона 4-1);

учета результатов амплификации нуклеиновых кислот методом секвенирования и (или) на ДНК-чипах (Рабочая зона 4-2)

При детекции продуктов амплификации в режиме реального времени возможно совмещение Рабочей зоны 2 и Рабочей зоны 3 в одном помещении при наличии в нем отдельных боксов биологической безопасности II или III класса для каждой из рабочих зон. Детектирующие приборы размещают в смежных с чистой зоной помещениях, и все операции могут быть выполнены одним сотрудником.

Рабочие зоны 4-1 и 4-2 располагают изолировано от Рабочих зон 1-3 для предотвращения их контаминации продуктами амплификации через воздушный поток. Выполнение работ в этих зонах должно осуществляться отдельным персоналом, не задействованным на других этапах проведения анализа.

Помещения лаборатории должны быть боксированными (боксы с предбоксами) и оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией, водопроводом, канализацией, электричеством и отоплением.

17

Всостав лаборатории могут быть включены вспомогательные помещения (комнаты персонала, раздевалки для сотрудников, комната приема пищи, подсобные помещения), которые должны быть вынесены за пределы рабочей зоны

всоответствии с действующими санитарными правилами, регламентирующих обеспечение безопасности работ с микроорганизмами I–IV групп патогенности.

Передачу исследуемого материала в Рабочую зону 1 и проб при смежном расположении помещений Рабочих зон 1, 2, 3 желательно осуществлять через шлюзовые передаточные окна, а в Рабочие зоны 4-1 и 4-2 – через передаточные окна.

Запрещается внесение пробирок с положительными контролями или клиническими образцами в комнату подготовки реакционной смеси («чистую» зону) как до, так и после их обработки.

Впомещениях рабочих зон должны быть установлены бактерицидные лампы. При исследовании материала, подозрительного на зараженность микроорга-

низмами I–IV групп патогенности, все манипуляции в Рабочих зонах 1 и 2, включая манипуляции, сопровождающиеся риском образования аэрозоля (встряхивание, центрифугирование и т.д.) при обработке материала и выделении нуклеиновых кислот, выполняют в боксах биологической безопасности II или III класса.

Каждая самостоятельная рабочая зона должна быть оснащена минимальным набором соответствующего лабораторного оборудования в зависимости от их функционального назначения и риска контаминации, необходимым комплектом мебели, пластиковой и стеклянной посуды, расходных материалов, защитной одежды и уборочного инвентаря, используемых только в данном помещении.

Требования к проведению работ. Не допускается проведение работ, связанных с использованием МАНК, в помещениях, где осуществляются культуральные работы по накоплению биомассы биологических агентов I–IV групп патогенности и генно-инженерные работы.

Выполнение работ в Рабочих зонах 4-1 и 4-2 должно осуществляться отдельным персоналом, не задействованным на других этапах проведения анализа.

При проведении исследований с использованием МАНК неукоснительно соблюдают поточность движения исследуемого материала, проб нуклеиновых кислот, продуктов амплификации.

Перенос проб из одной рабочей зоны в другую, а также их хранение в данных помещениях рекомендуется осуществлять в плотно закрывающихся металлических (с возможностью опломбирования) или пластмассовых контейнерах (штативах), с их последующей обработкой регламентируемыми дезинфицирующими средствами после каждого использования.

Условия хранения наборов реагентов (комплектов реагентов), образцов проб должны соответствовать инструкциям по применению. Образцы проб, содержащих нуклеиновые кислоты и (или) ампликоны, хранят отдельно от реагентов в разных холодильниках.

Не допускается использование не сертифицированных наборов, реагентов с истекшим сроком годности, хранившихся в условиях нарушения температурного режима.

18

Требования к защитной одежде. Каждая рабочая зона (помещение) обеспечивается необходимым количеством комплектов спецодежды.

При работе в помещении детекции продуктов амплификации следует надевать одноразовые бахилы. Использование одежды из другой зоны запрещено. Рекомендуется использование одноразовой одежды.

Надевание и снятие защитной одежды производят в предбоксах. Наиболее загрязненной продуктами амплификации считается защитная одежда Рабочих зон 4-1 и 4-2, особенно перчатки, которые снимают в первую очередь.

Требования к обработке помещений и обеззараживанию материала.

Ежедневно в конце рабочего дня проводят текущую влажную уборку полов разрешенными к применению дезинфицирующими средствами. Каждая рабочая зона (помещения) лаборатории должна быть обеспечена промаркированным набором уборочного инвентаря, который не должен использоваться для уборки других помещений лаборатории.

Рабочие зоны (помещения) лаборатории должны подвергаться ежедневному обеззараживанию ультрафиолетовым излучением в после окончания работы.

Перед началом работы рабочую поверхность столов (биологических боксов) и оборудования обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом.

Не менее чем один раз в год осуществляют обработку автоматических дозаторов.

Остатки материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) микроорганизмами I-IV групп патогенности, использованную посуду после дезинфекции регламентируемыми дезинфицирующими препаратами (если необходимо) собирают в закрывающиеся емкости (контейнеры) и передают на автоклавирование. Не допускается слив необеззараженных жидкостей в канализационную сеть.

При возникновении контаминации в помещениях лаборатории, использующей МАНК, немедленно останавливают работы и проводят мероприятия по ликвидации контаминации.

19