Методы лабораторной диагностики бактериальных менингитов (менингоэнцефалитов) Учебно-методическое пособие

Физико-химические свойства ликвора

Определение с помощью диагностических полосок Капля аккуратно размешанного ликвора наносится на соответствующую ре-

активную зону с помощью пипетки. Ликвор сразу пропитывает пористую подушечку, окраска которой изменяется в зависимости от концентрации определяемого вещества.

С помощью диагностических зон полифункциональных полосок можно определить относительную плотность, кровь (гемоглобин), лейкоциты (нейтрофилы), билирубин, глюкозу, кетоны и нитраты. рН ликвора нужно определять, используя рН-метр.

Общий белок определяют турбидиметрическими методами (изменение мутности при добавлении трихлоруксусной или сульфосалициловой кислоты и сульфата натрия), колориметрическими методами (метод Лоури, метод Бредфорд с краской Кумасси G250, метод пирагаллоловый красный) и с использованием диагностических полосок.

Общие сведения о физико-химических свойствах ликвора в норме и его составе отображены в таблице 2.

Таблица 2

Физические свойства и состав ликвора в норме

Микроскопия ликвора проводится с целью определения цитоза – общего количества клеточных элементов в 1 мкл или в 1 мл ликвора с последующей дифференциацией клеточных элементов (ликворная формула), а также в некоторых случаях для подсчета эритроцитов. Весьма важным является, чтобы подсчет количества форменных элементов в ликворе проводился в течении первых 30 минут после проведения люмбальной пункции. Этим обеспечивается наибо-

10

лее оптимальная количественная оценка полученных данных. При этом для подсчета лейкоцитов производят предварительное окрашиванием препарата одним из следующих реактивов:

1)5 мл 10% раствор ледяной уксусной кислоты + 0,1 метилового фиолетового + вода до 50 мл – время окрашивания составляет 2 минуты;

2)Реактив Самсона: 2,5 мл спиртового раствора фуксина 1:10 + 30 мл уксусной кислоты + 2 мл концентрированной карболовой кислоты + дистиллированной воды до 100 мл, время окрашивания составляет 10–15 минут.

После окрашивания препарат помещают в камеру Фукса-Розенталя объемом 3 мкл. Лейкоциты считают на малом увеличении во всех 16 больших (малых

256)квадратах. Е.М. Цветанова (1986) в случае большого плеоцитоза рекомендует считать клетки в больших квадратах. Если в них обнаруживают до 1000 клеток – в 8 больших квадратах (половина больших квадратов), результат умножить на 2; если до 3000 клеток – в 4 больших квадратах (один ряд), результат умножить на 4; если до 4000 клеток – в 2 больших квадратах, результат умножить на 8; если до 5000 клеток – в 1 большом квадрате, результат умножить на 16; если количество клеток очень большое, то считают в одном большом квадрате и умножают на 256. Полученное число затем делят на 3 (для оценки количества клеток в 1 мкл). Подсчет эритроцитов проводят в камере Горяева по правилам, аналогичным для подсчета эритроцитов крови.

Клеточные элементы ликвора оценивают в окрашенных азуром и эозином мазках, приготовленных из осадка обычного центрифугированного ликвора, на цитоцентрифуге или методом седиментации на аппарате Сайка. Клетки ликвора, кроме арахноэндотелиальных клеток и клеток эпендимы, имеют гематогенное происхождение и представлены лимфоцитами, моноцитами, нейтрофилами, редко эозинофилами, гистиоцитами (макрофагами), базофилами, плазматическими клетками, бластами, клетками эпендимы, арахноэндотелия, клетками опухолей.

МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

Важнейшую роль в диагностике менингитов (менингоэнцефалитов) играют микробиологические методы. Именно с помощью них удается установить этиологию заболевания и, соответственно, наиболее эффективно и рационально назначить антибактериальную терапию, исходя из чувствительности выделенных штаммов микроорганизмов к антибиотикам различных групп.

В качестве методов экспресс-диагностики может быть использована реакция латекс-агглютинации. Она может проводиться при обнаружении воспалительных изменений в ликворе для предварительной постановки диагноза. Для этого используют надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования при 2000 об/мин предварительно прогретого в течение 5 минут до 100 °С ликвора. Каплю лакмусового реактива наносят на специальные карты и добавляют 30 мкл надосадочной жидкости. Полученную смесь перемешивают и оценивают формирование агглютинации. Наличие последней говорит о присутствии в пробе ликвора искомого антигена.

11

Еще одной методикой, применяющейся в экспресс-диагностике, является встречный иммуноэлектрофорез. Данный метод основан на движении друг к другу материала, содержащего антитела и антигены в поддерживающем геле под воздействием электрического поля с формированием преципитата. Учет результатов проводят с помощью увеличительного стекла в проходящем или падающем свете.

Нужно отметить, что методы экспресс-диагностики, к сожалению, не обладают достаточной эффективностью в детекции возбудителей заболевания, что предопределяет необходимость применения более сложных методов диагностики.

Одним из основных методов является микроскопический. Первоначально ликвор центрифугируют. Затем образец из осажденного слоя наносят на предметное стекло и высушивают в условиях термостата при 37 °С или при комнатной температуре. После этого на приготовленный препарат наносят водноспиртовой раствор красителя метиленового синего, проводят экспозицию в течение 2-х минут. По истечении указанного времени образец промывают водопроводной водой. Затем, дождавшись подсушивания препарата, проводят микроскопическое исследование с использованием иммерсионного объектива микроскопа (×1000). При этом просматривают не менее 20 полей зрения. Допускается микроскопическое исследование до обнаружения четко морфологически очерченных клеток микроорганизмов.

Микроскопическое исследование с окраской препарата по Граму

Проводят окрашивание по Граму в модификации Калины. Первоначально на обезжиренное стекло наносят около 0,05 мл стерильного физиологического раствора. Затем в него помещают биологический образец в аналогичном количестве. После этого вносят 0,02 мл спиртового раствора бриллиантовой зелени. Затем необходимо дождаться высыхания препарата при комнатной температуре. После этого препарат фиксируют в пламени горелки. Проводят окрашивание препарата по Граму по стандартной методике.

Приготовление препарата крови «толстая капля». Приблизительно на середину предметного стекла наносят каплю крови, которую затем с помощью стерильного аппликатора аккуратно и равномерно концентрически распределяют до достижения диаметра около 1,5 см. После высыхания препарата на образец наносят спиртовой раствор метиленового синего и выдерживают его в течение 2–3 минут. Затем препарат промывают проточной водой и высушивают при комнатной температуре. Микроскопическое исследование проводят с использованием иммерсионного объектива микроскопа (×1000). При этом просматривают не менее 20 полей зрения.

Полученные в ходе бактериоскопии данные должны быть в обязательном порядке подтверждены культуральными (бактериологическими) методами.

Для этих целей проводится посев ЦСЖ и крови. Непосредственно после проведения спинальной пункции образец ликвора помещают на поверхность шоколадного агара. На питательную среду вносят 3–4 капли ЦСЖ. После этого, чашку Петри закрывают и аккуратно равномерными круговыми движениями

12

распределяют ликвор по всей поверхности агара. Кроме того, 5–6 капель ликвора вносят в пробирку с 0,1 % полужидким сывороточным агаром. Чашки Петри и пробирки с клиническим материалом инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 24–48 ч в условиях атмосферы, обогащенной СО2 до 5–10 %. После этого проводят идентификацию выделенных микроорганизмов до вида. Быстрой и точной является идентификация при помощи прямого белкового профилирования белков микроорганизмов, например MALDI-TOF масспектрометрия с использованием аппарата Bruker (Германия) с программным обеспечением Biotyper. После окончательной верификации возбудителей заболевания, определяют их чувствительность к антибиотикам различных групп. Рекомендуется определение минимальной подавляющей концентрации (МПК), для некоторых возбудителей допускается диско-диффузионный метод определения чувствительности к антимикробным препаратам.

Посев образцов крови выполняют во флаконы, содержащие «двухфазную» питательную среду, приводя соотношение крови к жидкой фазе к 1:10. После этого образцы крови инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 5 суток. После этого ежедневно производится контроль образцов на предмет наличия роста бактерий, признаками которого является помутнение среды, появление осадков, хлопьев, газообразование. При отсутствии роста в течение 48 часов, проводят посев образцов на «шоколадный» агар. В случае отрицательных результатов роста при посеве инкубацию флаконов продолжают еще в течение 72 часов. При обнаружении роста микроорганизмов проводят микроскопическое исследование препаратов, окрашенных по Граму. После проведения микроскопического исследования выполняют посев на шоколадный агар для детекции менингококков, пневмококков и гемофильной палочки (рис. 2). В случае предварительного обнаружения при бактериоскопии иных возбудителей могут быть использованы другие питательные среды, такие как среда Эндо, среда Сабуро, желточно-солевой агар.

Рис. 2. Типичные колонии менингококка на шоколадном агаре.

13

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВЫДЕЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

К АНТИБИОТИКАМ РАЗЛИЧНЫХ ГРУПП

Методы определения чувствительности микроорганизмов подразделяют на методы серийных разведений и диффузные методы. Методы серийных разведений в бульоне и агаре основаны на прямом воздействии антимикробного препарата (АМП) и количественном определении минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотика по отношению к исследуемому микроорганизму. Диффузионные методы основаны на подавлении роста исследуемой культуры при диффузии из носителя антибактериального препарата в плотную питательную среду. Существуют две модификации диффузионного метода: дис- ко-диффузионный и Е-тест (рис. 3).

Рис. 3. Е-тест и диско-дифуззионный метод определения чувствительности микроорганизма к антимикробным препаратам.

Диско-диффузионный метод – качественный метод. Он позволяет отнести исследуемый микроорганизм к чувствительным (S), умеренно устойчивым (I) и устойчивым (R) штаммам. Благодаря простоте исполнения он является основным для практических лабораторий. Е-тест – количественный метод, непосредственно определяющий МПК антибиотика. Распространение получили тестсистемы для определения лекарственной чувствительности, в основе которых лежит метод микроразведений антибиотиков. Это позволяет стандартизировать подготовительные этапы исследования, оценивать результат визуально или с применением различных автоматизированных систем. Одной из разновидностей метода серийных разведений является метод, основанный на использовании двух концентраций антибиотика, соответствующих пограничным значениям МПК. Такая тест-система представляет собой пластиковую полоску с расположенными на ней двумя рядами лунок. Каждый антибактериальный препарат, представленный на полоске, в первой лунке содержит «малую» пороговую концентрацию лиофилизированного антибиотика, а во второй лунке «большую»

14

пороговую концентрацию. Первая пара лунок не содержит антибиотик и служит для контроля роста исследуемой культуры. Последняя пара лунок нужна для дополнительного тестирования культуры на чувствительность к препаратам, не входящим в набор системы. Результат оценивают по наличию или отсутствию мутности (роста) в лунках. Наличие роста в лунках с «малой» и «большой» концентрацией антибиотика свидетельствует о резистентности культуры к данному антибиотику. Наличие роста в лунке с «малой» концентрацией препарата и отсутствием роста в лунке с «большой» концентрацией - указывает на умеренную устойчивость штамма. Отсутствие роста в обеих лунках позволяет отнести исследуемую культуру к чувствительным штаммам. Представляется перспективным использование тест-систем для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке.

МЕТОДЫ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – это сложная серологическая ре-

акция, в которой выявляют неизвестные микробные антигены (АГ) с помощью известных сывороток (антител – АТ), меченных или связанных с флуорохромами. Возбуждаемое внешним излучением свечение позволяет обнаружить АГ при помощи люминесцентного микроскопа. В качестве стандартного флуорохрома обычно используют флуоресцеин-изотиоцианат (ФИТЦ), прочно связывающийся с глобулинами антител.

Различают две разновидности метода: прямой и непрямой (рис. 4). Прямой метод РИФ (ПИФ) основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии и вирусы в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся в клетках зеленым цветом (рис. 5).

Непрямой метод РИФ (НИФ) заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулинов (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

15

Рис. 4. Реакция ПИФ (А) и НИФ (Б) для обнаружения антител и антигенов.

Рис. 5. Вирус герпеса в ядрах эпителиальных клеток. ПИФ. Увеличение ×1000. Масляная иммерсия.

Другие серологические реакции для обнаружения специфических антигенов и антител

Реакция связывания комплемента (РСК) – это сложная многокомпонент-

ная серологическая реакция. В ней используют две конкурирующие системы АГ и АТ и один комплемент. Первую систему называют исследуемой или тестсистемой, вторую – индикаторной или гемолитической.

16

РСК заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент, т.е. происходит связывание комплемента комплексом АГ-АТ. Если же комплекс не образуется, то комплемент остается свободным. PCK проводят в две фазы: 1-я фаза – инкубация смеси, содержащей АГ + АТ + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) – выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана (АГ) и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса АГ-АТ происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если АГ и АТ не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит – антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная). РСК имеет много компонентов, поэтому ставят несколько контролей. Все компоненты используют в эквивалентных количествах. Так же, как и другие серологические реакции, РСК применяют для серодиагностики и сероидентификации (рис. 6).

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) – (Indirect hemagglutination test) – метод выявления антигенов и антител, основанный на способности эритроцитов, на поверхности которых предварительно адсорбированы антигены или антитела, агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток или соответствующих антигенов (рис. 7).

При обнаружении антигенов реакция обозначается обратной пассивной ге-

магглютинацией – РОПГА (reversed passive hemagglutination test), а при обна-

ружении антител – пассивной гемагглютинацией – РПГА (passive hemagglutination test). РНГА нашла широкое применение для выявления серологических маркеров инфицирования вирусом гепатита В, особенно HBsAg и антител к нему.

В настоящее время разработаны различные методы изготовления эритроцитарных диагностикумов, отличающихся по способам сенсибилизации эритроцитов (с помощью танина, глютарового альдегида, хлористого хрома, риванола и т. п.), их видовой принадлежности (человека, барана, курицы, индюка и т. д.), вариантам постановки реакции (в планшетах для микротитрования, в пробирках, капиллярах и т. д.) и учета результатов (визуальный и инструментальный).

17

Эритроцитарные диагностикумы для выявления HBsAg и анти-HBs выпускаются многими предприятиями и фирмами как у нас в стране, так и за рубежом.

Рис. 7. РНГА для обнаружения антител или антигенов.

Чаще РНГА проводится в планшетах для микротитрования, в которых предварительно приготовляются разведения исследуемой сыворотки и контрольных образцов. После внесения эритроцитарного диагностикума и инкубации проводится учет результатов реакции. Положительными считают образцы, в которых происходит агглютинация эритроцитов, имеющая вид перевернутого “зонтика”. При отрицательной реакции – эритроциты оседают на дно лунки в виде кольца, диска или пуговки.

Для выявления антител или антигенов в биологических жидкостях может использоваться иммуноферментный анализ (ИФА).

ИФА (англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) – сложная серо-

логическая реакция – серодиагностика и сероидентификация с обязательным участием АТ меченных ферментами. Самый популярный в современных лабораториях иммунологический метод качественного или количественного определения различных низкомолекулярных соединений, макромолекул, вирусов

ипр., в минимальных концентрациях (нг/л) в основе которого лежит специфическая реакция антиген – антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для визуализации реакции.

Предполагали, что серологический метод основан на изучении сыворотки больного с целью определения в ней АТ. Однако впоследствии сфера применения серологического метода расширилась, т.к. разработаны высокочувствительные серологические реакции, предполагающие обнаружение как АТ, так и АГ не только в сыворотке крови больных, но в слюне, ликворе, эякуляте, моче

ив других биологических жидкостях. Серологические исследования имеют огромное практическое значение в современной клинической и лабораторной диагностике инфекционных, аутоиммунных, эндокринных и других заболеваний (рис. 8, 9).

18

Рис. 8. Общие принципы ИФА.

Рис. 9. Иммуноферментный анализ (ИФА).

19