3. Изучение острой токсичности

Методы изучения:

• Фиксированной дозы (по протоколу OECD 420 ГОСТ 32296-2013 «Методы испытаний по воздействию химической продукции на организм человека. Основные требования к проведению испытаний по оценке острой токсичности при внутрижелудочном поступлении методом фиксированной дозы»).

Данное исследование направленно на изучение токсичности соединений, которые заведомо, на основании имеющихся данных, могут быть отнесены к группе нетоксичных или малотоксичных веществ, 2000 мг/кг < ЛД50 < 5000 мг/кг.

По результатам исследования веществу присваивают класс токсичности по:

1. Классификации Globally Harmonised System (GHS) – к категории 5 GHS

2. Hodge и Sterner - к классу 4 (малотоксично)

3. К.К.Сидорову – к классу 5 (практически нетоксично)

4. ГОСТ 12.1.007-76 – к 3 классу токсичности (умеренно опасно)

Максимальная доза может быть ограничена предельными объемами для введения

Определенные ограничения накладывают:

- растворимость лекарственной формы,

- содержание активного вещества в объеме,

- предельно допустимые объемы введения для данного вида лабораторных животных.

Данное исследование направленно на изучение токсичности лекарственных форм, применение которых заведомо не позволит достичь максимальных доз, приемлемых для изучения острой токсичности.

• Классовый метод (по протоколу OECD 423 ГОСТ 32644-2014 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Острая пероральная токсичность - метод определения класса острой токсичности»).

Данный метод является воспроизводимым, предполагает использование небольшого количества животных и позволяет ранжировать вещества таким же образом, как и в исследованиях острой токсичности согласно OECD 420.

Данный метод не предназначен для вычисления точного значения ЛД50.

Использование данного подхода позволяет классифицировать вещество на основании международной гармонизированной системы классификации опасности OECD (globally harmonised hazard classification and compatible labelling system, GHS), а также минимизировать количество животных в эксперименте и провести исследование в соответствии с гуманными принципами обращения с животными

• Метод вверх-вниз (по протоколу OECD 425);

Основан на процедуре вверх/вниз (метод Диксона).

Использование данного подхода позволяет классифицировать химические

субстанции на основании международной гармонизированной системы

классификации опасности OECD (globally harmonised hazard classification and

compatible labelling system, GHS).

Метод позволяет с использованием минимального числа животных точно вычислить ЛД50, даже если она неизвестна

Особенности этих методов изучения острой токсичности:

Летальность регистрируют в течение 24 часов.

- Интервал между введениями различных доз обусловлен характером течения интоксикации. Введение следующей дозы производят только в том случае, если есть уверенность в том, что все животные на текущей дозе выживут. Рекомендуется интервал в 3-4 дня между тестированиями.

- Наблюдение осуществляют 14 дней.

- Использование минимального числа животных.

- Описан для внутрижелудочного введения, для парентеральных путей введения требуется модификация.

• Изучение острой токсичности по Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных препаратов.

Данное исследование направленно на изучение токсичности соединений, которые заведомо, на основании имеющихся данных, не могут быть отнесены к группе нетоксичных или малотоксичных веществ (ЛД50 (внутрижелудочно (в/ж)) < 2000 мг/кг).

Основанием для выбора экспериментальных доз являются:

- литературные данные о летальных дозах ЛС,

- литературные данные о летальных дозах структурных аналогов ЛС,

-прогноз о токсичности на основании химической структуры вещества.

Достоинства:

- Пригоден для любого пути введения

- Количество животных в группах достаточно для статистической обработки данных

- Позволяет точно рассчитать ЛД50 и классифицировать вещество по токсичности

Недостатки:

Большой расход животных, как следствие, высокая стоимость исследования.

Вид и количество подопытных животных

Острую токсичность следует изучать на нескольких видах животных, причем обязательно использовать тот вид, на котором был показан терапевтический эффект фармакологического вещества и на котором будет исследована токсичность при длительном введении. Обычно используют 2-8 вида грызунов и не грызунов (мыши, крысы, морские свинки, кролики или др.). Группы самцов и самок подопытных животных формируют отдельно. Для мелких грызунов каждая группа должна содержать не менее 5-6 самок и такое же, количество самцов. Количество собак и кроликов в группе может быть 3-5.

Пути введения

У мелких лабораторных животных токсичность фармакологического вещества обычно исследуют при нескольких путях введения, причем обязательно использовать тот путь, при котором была показана терапевтическая активность фармакологического вещества, и путь, который предполагается для клинического изучения. Фармакологические вещества, предназначенные для системного введения, вводят внутрь и парентерально (внутрибрюшинно, если они не растворимы в воде, и подкожно, если они растворимы). Следует учитывать, что при определении токсичности имеет значение концентрация и объем вводимого фармакологического вещества, а при внутривенных инъекциях также скорость введения. Фармакологические вещества, предлагаемые для местного применения, наносят или вводят в соответствующую область согласно способу, предлагаемому для клиники. Кроме того, дополнительно изучают их токсичность при системном применении.

Фармакологические вещества, предлагаемые для приема внутрь, следует вводить через зонд, закладывать на корень языка, исключение могут составить полимеры, которые можно давать с пищей.

Фармакологические вещества, рекомендованные для ингаляции, изучают, помещая мелких лабораторных животных в затравочные камеры, снабженные специальными затравочными устройствами.

Сравнение параметров токсичности при разных путях введения может дать ориентировочные данные о скорости и степени всасывания фармакологического вещества, а сопоставление прямых, отражающих зависимость величины токсического эффекта от дозы, позволяет судить о сходстве или различии в механизмах, вызывающих летальный исход при разных путях введения.

Продолжительность наблюдения и регистрация картины интоксикации

Общая продолжительность наблюдения за животными при исследовании острой токсичности должна составлять не менее 2-х недель, причем в первый день после введения животные должны находиться под непрерывным наблюдением.

Регулярно фиксируют общее состояние животных, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координации движений, тонус скелетных мышц, реакцию на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители, частоту и глубину дыхательных движений, ритм сердечных сокращений, состояние волосяного и кожного покрова, окраску слизистых оболочек, размер зрачка, положение хвоста, количество и консистенцию фекальных масс, частоту мочеиспускания и окраску мочи, потребление кормами воды, изменение массы тела и другие показатели, которые могут быть использованы для выявления токсического эффекта. Для отдельных фармакологических веществ целесообразно исследовать некоторые гематологические показатели (морфологические, биохимические, свертываемость крови).

Весьма существенным является регистрация сроков развития интоксикации и гибели животных. Целесообразно проводить макроскопическое исследование внутренних органов погибших животных, а в случае отсроченной гибели животных и микроскопическое исследование (степень кровенаполнения органов, наличие кровоизлияний, изъязвлений слизистых оболочек и др.).