Лекция 3 Временная организация клетки. Клеточный цикл, его периодизация. Митотический цикл. Репликация днк. Митоз. Механизм регуляции митотической активности.

Для всех клеток характерен жизненный цикл. Жизненный цикл - это период существования клетки от момента её образования вследствие деления материнской клетки до появления следующего поколения или естественной гибели. Жизненный цикл клеток сложен по своей сути и неоднороден на своём протяжении. Для большинства клеток он включает в себя митотический (пролиферативный) цикл (рис. 1). Кроме того, в жизненный цикл ряда клеток входит период выполнения клеткой специальных функций, входит сюда и период покоя. В период покоя клетка выбирает себе дальнейший путь: либо делиться, либо специализироваться в каком-то направлении. Весьма важным для жизненного цикла многих клеток многоклеточного организма является наличие митотического цикла. Понятие митотический цикл клетки непосредственно связано с представлениями о процессах митоза, который обеспечивает преемственность хромосом (и следовательно, геномов, генов) в ряду клеточных поколений. С митозом связано образование клеток равноценных по количеству ДНК и содержанию наследственной информации.

Митотический цикл - это совокупность процессов, которые происходят с клеткой в период подготовки к делению и на протяжении самого деления. Дочерние клетки, которые возникли в результате деления, могут сразу приступать к подготовке к следующему делению. В этом случае митотический цикл клетки совпадает с её жизненным циклом. Хотя наши знания о молекулярных основах митотического цикла довольно фрагментарны, мы постараемся представить основные механизмы этого процесса.

Рис. 1. Митотический цикл

Период подготовки клетки к делению называют интерфазой и он составляет не менее 90% времени митотического цикла. На протяжении всего интерфазного периода синтезируется большая часть компонентов клетки. Это затрудняет выделение различных стадий в интерфазе делящихся клеток. Исключение составляет лишь синтез ДНК, поскольку ДНК клеточного ядра реплицируется в определенный период, составляющий лишь часть интерфазы. Этот период был назван синтетическим (S). Вторая чётко выраженная стадия цикла - это фаза клеточного деления, включающая деление ядра (митоз), а затем и цитоплазмы (цитокинез). Период между митозом и началом синтеза ДНК обозначают как период G1 (пресинтетический), а период между завершением синтеза ДНК и последующим митозом - как период G2 (постсинтетический) (рис. 1).

Таким образом, интерфаза включает пресинтетический, синтетический и постсинтетический периоды. В интерфазу ядро находится в состоянии наивысшей метаболической и синтетической активности. При этом проявляется активность всех генов.

Длительность митотического цикла составляет для разных клеток от 8 до 50 часов, но для большинства делящихся клеток этот период длится 18-24 часа. Различные периоды занимают разное время: G1 занимает до 30-40% всего митотического цикла, S - до 30%, G2 - 10-20% и митоз составляет 5-10%.

Пресинтетический период (G1). В этот период в клетке синтезируются белки, углеводы, липиды, РНК, АТФ, начинается синтез и сборка органелл. К концу этого периода увеличивается уровень дезоксирибонуклеотидов - предшественников ДНК, но синтеза ДНК не происходит. Клетка в этот период содержит диплоидный набор хромосом (2n2c). Некоторые клетки делятся очень медленно, оставаясь в G1 многие дни и даже годы, выполняя специфические функции. Нередко такую часть митотического цикла обозначают как период G0.

Чтобы клетка из G1 периода могла вступить в S период она должна пройти точку рестрикции в конце G1. Это определенный момент в конце периода G1, после прохождения которого возврат в G1 невозможен. После того как клетки минуют точку рестрикции они неизбежно завершат цикл, проходя его с обычной скоростью, независимо от внешних условий. Пока точно не известно от чего зависит прохождение клеткой млекопитающего точки рестрикции в G1. Предполагают, что для прохождения точки рестрикции из цитоплазмы к генам ядра должен поступить сигнал для активирования определенных генов. Считается, что сигнальную функцию при этом выполняют специфические белки цитоплазмы.

Синтетический период (S). Это важнейший этап митотического цикла. В этот период происходит удвоение наследственного материала, авторепродукция хромосом. Генетическая информация двух дочерних клеток, которые возникнут путем деления одной материнской клетки, должна быть полноценной. Это можно достигнуть лишь путем воспроизведения молекулярных структур каждой исходной хромосомы в двух дочерних, что происходит путем их авторепродукции. Непосредственно авторепродукция хромосом происходит в S период. В результате вместо одной хромосомы образуется две дочерних, которые связаны центромерой. Такие дочерние хромосомы, которые являются внешне самостоятельными, но ещё не отделены друг от друга получили название хроматид. В основе авторепродукции хромосом лежит репликация (синтез) ДНК хромосом. При репликации на основе материнской ДНК синтезируются две новых дочерних молекулы ДНК. Каждая из двух старых цепей исходной ДНК служит матрицей для образования новой цепи. Дезоксирибонуклеотиды включаются в синтезируемые новые цепи ДНК по принципу комплементарности. Напротив гуанилового нуклеотида встает цитидиловый, а напротив аденилового - тимидиловый. В конечном итоге будет синтезироваться две молекулы ДНК идентичные по последовательности нуклеотидов исходной (материнской). В каждой новой молекуле ДНК, возникшей в результате репликации, молекула образована одной материнской цепью и одной заново образованной дочерней. Такой способ репликации ДНК получил название полуконсервативный.

Репликация ДНК в клетках эукариот происходит не единым блоком от одного конца молекулы до другого, а начинается одновременно во множестве участков, получивших название репликоны (рис. 2). Таким образом, репликон - это единица репликации ДНК и синтез ДНК начинается одновременно в большом числе репликонов. Например, в ДНК хромосом соматической клетки человека может быть до 50 тысяч репликонов. Каждая эукариотическая хромосома при репликации ДНК представляет собой полирепликон.

Рис. 2. Репликон

Средняя хромосома человека состоит из одной молекулы ДНК, содержащей около 150 млн. пар нуклеотидов. Если бы ДНК удваивалась единым блоком от начала молекулы до ее конца, то на репликацию такой хромосомы потребовалось 800 часов. В действительности S период продолжается 8-10 часов.

Механизм репликации ДНК процесс сложный, в нем участвует комплекс различных белков, получивший название репликационный комплекс. В клетках человека процесс репликации контролируют сотни генов. В этом процессе выделяют три стадии: инициация (начало репликации), элонгация (наращивание полинуклеотидной цепи) и терминация (окончание репликации).

Репликация в каждом репликоне начинается с точки инициации репликации (точка ori). В этом месте происходит расплетание и разделение закрученных в биспираль полинуклеотидных цепей материнской ДНК, чтобы дезоксирибонуклеотиды при синтезе ДНК могли комплементарно спариваться с родительской матричной цепью. Эту функцию расплетания выполняют белки-ферменты ДНК-геликазы. ДНК-геликаза раскручивает двойную спираль, разрывая водородные связи между основаниями. Местное разделение полинуклеотидных цепей ДНК при сохранении двуцепочной структуры на остальном протяжении биспирали должно было приводить к быстрому вращению всей хромосомы, а это для длинных хромосом потребовало бы большой затраты энергии. Эту проблему природа решила следующим образом. Есть фермент ДНК-топоизомераза, которая временно разрывает одну цепь ДНК, что дает возможность спирали ДНК вращаться вокруг фосфодиэфирной связи, находящейся напротив разрыва, и тем самым ослаблять напряжение. Реакция, приводящая к разрыву цепи, обратима и разорванные цепи затем соединяются вновь при участии того же фермента. Активная зона, где происходит репликация, была названа репликационной вилкой, из-за своей Y- образной формы (рис. 3).

Рис. 3. Репликационная вилка

При репликации ДНК в каждом репликоне происходит двунаправленный рост двух цепей от одной точки ori с формированием двух репликационных вилок. В среднем в S-периоде в каждой хромосоме млекопитающих функционирует около 100 вилок.

Как функционирует репликационная вилка, каким образом идёт сборка полинуклеотидных цепей? Сборку новых обеих цепей (элонгация) ведет фермент (5`→3`)-ДНК-полимераза. Она может вести синтез полинуклеотидной цепи только в направлении от 5`- к 3`- концу с добавлением по одному нуклеотиду к 3`-концу растущей цепи ДНК. Поскольку две цепи спирали ДНК антипараллельны, то есть одна цепь располагается в направлении от 5`- к 3`-концу, а другая - от 3`- к 5`- концу, поэтому одна цепь будет синтезироваться непрерывно в направлении 5`→3` и быстро. Поскольку существует только один фермент, способный синтезировать цепь в направлении 5`→3`, и не существует фермента (3`→5`)-ДНК-полимеразы, вторая цепь будет синтезироваться в обратном порядке, но тоже в направлении 5`→3`. Причём синтезироваться она будет участками, которые были названы фрагменты Оказаки, насчитывающие у эукариот несколько сот нуклеотидов. Затем синтезированные в направлении 5`→3` фрагменты Оказаки объединяются в длинные цепи ферментом ДНК-лигазой и в целом получается, что цепь наращивается в направлении 3`→5`.

Таким образом, репликационная вилка ассимметрична. Это значит, что из двух синтезируемых дочерних цепей ДНК одна строится непрерывно, быстро (лидирующая цепь), а другая цепь синтезируется прерывисто, фрагментами, её синтез идёт медленнее (отстающая цепь). Благодаря тому, что ДНК на отстающей цепи вилки строится при помощи механизма, работающего по типу «шитья назад иголкой», в репликационной вилке не требуется никакого другого фермента, кроме (5`→3`)-ДНК-полимеразы. Итак, в репликационной вилке работают две идентичные молекулы ДНК-полимеразы, одна из них синтезирует ведущую цепь, а другая – отстающую.

В процессе репликации есть еще один очень важный момент. ДНК-полимераза не может начать синтез новой полинуклеотидной цепи, просто связав друг с другом два нуклеотида. Для присоединения нуклеотидов ей необходим для этого свободный 3`- OH-конец какой-либо полинуклеотидной цепи, которая должна быть спарена с матричной цепью ДНК. ДНК-полимераза способна только добавлять новые нуклеотиды к уже имеющемуся 3`-концу полинуклеотидной цепи. Эту заранее образованную цепь, к которой добавляются нуклеотиды, называют РНК-затравкой или праймером. Такие затравки производит фермент РНК- полимераза, называемая праймазой. Она синтезирует из рибонуклеотидов короткие РНК-затравки (праймеры), состоящие примерно из 10 нуклеотидов, и для этого не требуется свободный 3`-конец. Синтез лидирующей цепи начинается с праймера и может продолжаться непрерывно вслед за движением вилки. На матрице для отстающей цепи эти праймеры синтезируются с определенными интервалами, здесь их наращивает ДНК-полимераза, добавляя дезоксирибонуклеотиды, начиная, таким образом, всякий раз новый фрагмент Оказаки. Чтобы обеспечить образование непрерывной цепи ДНК из многих фрагментов в действие вступает особая система репарации ДНК, она быстро удаляет РНК-затравки и заменяет их отрезкоми ДНК, а фермент ДНК-лигаза затем сшивает все фрагменты отстающей цепи. После этого завершается репликация ДНК (терминация).

Механизм репликации ДНК характеризуется исключительной точностью (одна ошибка на 10⁹ присоединенных нуклеотидов), хотя возможны и ошибки при спаривании комплементарных нуклеотидов. Часть этих ошибок устраняет сама ДНК-полимераза, обладая 3`-5`- экзонуклеазной активностью. Она удаляет неправильно спаренный нуклеотид и продолжает синтез новой цепи в направлении от 5`- к 3`- концу. Таким образом, ДНК-полимераза проводит самокоррекцию или редактирование.

По мере репликации ДНК в состав хромосом включаются новые гистоны, необходимые для сборки сестринских хроматид. Синтезируются гистоны быстро, главным образом в S-периоде, хотя все другие белки синтезируются на протяжении всей интерфазы. Таким образом, в период S происходит удвоение количества ДНК в клетке при сохранении диплоидного набора хромосом. При этом каждая из хромосом оказывается удвоенной, состоящей из двух хроматид (2n4c).

Имеются особенности репликации ДНК теломер – концов эукариотических хромосом. Репликация концов синтезируемых цепей ДНК не может пройти полностью. После удаления праймеров ДНК-полимераза не сможет восстановить 5`- концы, так как необходимые праймеры не могут присоединяться дальше конца матрицы и 5`- концы остаются недореплицированными (рис. 4).

Рис. 4. Недореплицированные концы ДНК

В силу недорепликации 5`-концов в хромосоме остаются выступающие 3`-концы, которые будут разрушаться клеточными ферментами экзонуклеазами. В связи с этим в каждом цикле деления клетки теломеры будут укорачиваться. Этот феномен носит название концевой недорепликации и лежит в основе ограниченного потенциала деления нормальных соматических клеток («лимита Хейфлика»). Укорочение хромосом до известного предела приводит к выходу клетки из пролиферативного цикла с единственной перспективой погибнуть. Это касается многих типов соматических клеток организма. Однако восстановление концов линейных ДНК в ряде клеток возможно благодаря функционированию специального фермента – теломеразы. Этот фермент активен в клетках зародышевой линии, в стволовых и раковых клетках. Теломераза - это РНК- зависимая ДНК – полимераза (обратная транскриптаза), помимо белковых субъединиц содержит специальную РНК, выполняющую роль матрицы для наращивания ДНК комплементарными повторами. В соматических клетках фермент теломераза репрессирован.

С окончанием синтеза ДНК в S период начинается постсинтетический период (G2). В постсинтетический период завершается удвоение массы цитоплазмы, которое связано с интенсивным синтезом белков, РНК, сборкой органелл. Синтезируются в этот период и белки, которые используются для построения микротрубочек клеточного центра и веретена деления, происходит синтез АТФ и его накопление.

На этом заканчиваются события удвоения наследственного материала и начинается разделительная фаза клеточного деления - равномерное распределение наследственного материала между дочерними клетками, начинается непрямое деление ядра (митоз, кариокинез). В митоз, когда конденсация (спирализация) хромосом, вероятно, препятствует транскрипции, синтез РНК почти не идет и образование белка в клетке снижается. В митозе выделяют 5 фаз: профазу, прометафазу, метафазу, анафазу и телофазу (рис. 5).

Профаза. Клетка становится округлой, повышается вязкость цитоплазмы. Центриоли, которые в интерфазу удвоились, расходятся, формируя два митотических центра. Образуется биполярное митотическое веретено. Митотическое веретено представляет собой систему волокон, состоящих из микротрубочек, и белков, ассоциированных с микротрубочками. Между митотическими центрами устанавливаются непрерывные (полюсные) нити веретена деления. Ядерная оболочка сохранена, но хромосомы, которые в интерфазе выглядят в виде диффузного хроматина, медленно конденсируются (спирализуются) в отчетливо видимые хромосомы. По мере спирализации хромосом ядрышки начинают разрушаться и постепенно исчезают.

Рис. 5. Митоз

Прометафаза. Начинается с быстрого распада ядерной оболочки на мелкие фрагменты. Нити веретена, которые были расположены вне ядра, проникают в ядерную зону. В хромосомах с каждой стороны центромеры образуются особые структуры, называемые кинетохорами. У большинства организмов кинетохор представляет собой крупный, состоящий из многих белков комплекс, который на электронных микрофотографиях выглядит как пластинчатая трехслойная структура. К кинетохорам присоединяются специальные микротрубочки, которые формируют прерывистые (кинетохорные) нити. Эти нити, отходя от обеих сторон каждой хромосомы, идут в противоположных направлениях и взаимодействуют с нитями биполярного веретена. При этом хромосомы начинают активно перемещаться, что объясняется взаимодействием их кинетохорных нитей с непрерывными нитями веретена. Движутся хромосомы в конечном итоге к области экватора клетки.

Метафаза. После ряда отклонений в ту и другую сторону, происходящих в прометафазе, все хромосомы располагаются в области экватора таким образом, что их центромеры лежат в одной плоскости, перпендикулярной оси веретена деления. Это состояние соответствует метафазе. За ориентацию хромосом перпендикулярно оси веретена и расположение их на равном расстоянии от обоих полюсов веретена отвечают кинетохорные нити. Каждая хромосома удерживается в метафазной пластинке парой кинетохоров и двумя пучками связанных с ними нитей, идущих к противоположным полюсам веретена. Число микротрубочек, ассоциированных с каждым кинетохором, у разных видов различно. В клетках человека от 20 до 40.

Анафаза. Начинается с одновременного разделения центромер и кинетохоров каждой хромосомы. Сестринские хроматиды внезапно расходятся, каждая хроматида начинает медленно двигаться к полюсу веретена. Что удерживает хроматиды вместе до начала анафазы пока точно неизвестно. Есть предположение, что это связано с нереплицированной ДНК центромеры. Репликация ДНК центромеры заканчивается гораздо позже чем репликация других участков. Запуск репликации центромер и приводит, очевидно, к разделению сестринских хроматид в анафазу. Контроль за наступлением анафазы - это одна из функций центромеры. Все хроматиды движутся к соответствующим полюсам с одинаковой скоростью и продолжается это несколько минут. По мере приближения хроматид (дочерних хромосом) к полюсам клетки кинетохорные нити становятся все короче и короче и, наконец, распадаются и исчезают.

Телофаза. В телофазу происходят все те же процессы, которые происходят в профазу и прометафазу, но только в обратном порядке. Исчезает веретено деления, хромосомы становятся менее компактными, происходит их деспирализация. Одновременно с этим реконструируется оболочка дочерних ядер. Из области организатора ядрышка вновь образуется ядрышко. Изменения имеют место и в цитоплазме, вязкость цитоплазмы снижается, центриоли утрачивают свою активность.

Цитокинез. Начинается деление цитоплазмы в анафазу и продолжается во время телофазы. Мембрана в средней части клетки впячивается внутрь, образуется борозда деления, которая постепенно углубляется, клетка делится на две дочерние (2n2c).

Митотическое деление клеток имеет большое значение, так как служит универсальным механизмом воспроизведения клеточной организации с обеспечением строго одинакового распределения хромосом и заключенной в них генетической информации между дочерними клетками. В тканях организма присутствуют факторы, которые влияют на митотическую активность, т. е. на деление (пролиферацию) клеток. Регуляция митотической (пролиферативной) активности клеток в многоклеточном организме осуществляется на разных уровнях (рис. 6).

Рис. 6. Уровни регуляции пролиферации клеток

Нарушение регуляции деления клеток может привести либо к развитию опухолей, либо к гибели организма.