2.6. Регуляция g2 фазы

Клетка в этот период растёт, ядерно-цитоплазматическое отношение уменьшается, а также исправляются ошибки, допущенные при репликации. Если никаких проблем с этим нет, то клетка может миновать точку транзиции G2/М и начать деление. В инициации деления участвует несколько киназ: уже знакомый нам комплекс Циклин В/Cdk1 (основной комплекс, но участвуют и другие), представители семейства NIMA-подобных киназ (NEK), киназы Aurora (А, В и С), а также Polo-подобные киназы (PLK).

За время интерфазы циклины аккумулируются в клетке и связываются со своими Cdk. Чтобы митоз не случился слишком рано, до достижения нормального объема клеткой, киназы Wee1 ингибируют активность целого комплекса, фосфорилируя циклин-зависимую киназу в участках Tyr15 и Thr14.

Чтобы вновь активировать этот фермент, требуются фосфатазы, а именно — представители Cdc25. Эти ферменты активны в фосфорилированном виде, таким образом, для их активации необходимо участие других киназ. Запускают процесс PLK, а далее, как Cyc B/Cdk1 освобождается от фосфатов, он становится способен сам активировать Cdc25, а также ингибировать Wee1. Комплекс циклин B/Cdk1 является ключевым агентом для разрушения ядра в профазу, образования веретена и других процессов, таким образом, если не произойдёт его активация, клетка застрянет в G2.

Polo-подобные киназы — семейство серин-треониновых киназ, имеющих один N-концевой киназный домен, консервативный, и один или несколько т.н. Polo-боксов — структур, необходимых для позиционирования киназ на сайтах связывания на центросомах, кинетохорах и митотическом веретене. На данный момент у человека нашли 5 PLK, которые принимают участие в определённых фазах клеточного цикла. Так, например, Plk1 играет большую роль в клеточном цикле, особенно в митозе, а также именно она фосфорилирует упомянутую Cdc25, обеспечивая переход G2/M, Plk2 участвует в дупликации центриолей, а Plk3 нужна для нормального прохождения цитокинеза. Plk активируются под действием киназ Aurora, а ингибируются преимущественно при активации каскада после обнаружения ошибок в ДНК, не давая клетке вступить в митоз до их исправления.

Семейство NEK, NIMA-подобных киназ, изучено в меньшей степени, чем остальные участники, и в отличии от остальных, при их дефектах не наблюдается нарушение во вступлении клетки в митоз. К слову, первоначально обнаруженная у гриба Aspergillus nidulans NIMA-киназа названа была так потому, что обладатели мутаций по гену, её кодирующему, не могли вступать в митоз (Never In Mitosis A), затем подобные белки были найдены у многих других эукариот. Судя по всему, в ходе эволюции, они перестали выполнять ключевую функцию регуляции транзиции G2/М (хотя и способствуют этому), зато стали играть огромную роль в регуляции стабильности генома, а также в образовании стабилизации веретена деления, конденсации и расхождении хромосом. У человека найдено одиннадцать представителей этого семейства, с NEK1 до NEK11, выполняющих разнообразные функции, в том числе и в неделящейся клетке.

Киназы Aurora, равно как и члены всех предыдущих семейств, являются серин-треониновыми киназами. Это семейство самое малочисленное: известно лишь три его представителя, Aurora A, B и C, причём киназы А и В очень похожи друг на друга как структурно, так и функционально, но тем не менее в клетке выполняют различные функции. Aurora A обеспечивает созревание центросом и расхождение их к полюсам, В — является хромосомным пассажиром и совместно с тремя белками, INCENP, Survivin и Borealin участвует в цитокинезе и способствует би-ориентации хромосом, в то время как Aurora С особенно ярко проявляет себя при мейозе, но и помогает двум предыдущим в ходе митоза. Активность этих киназ регулируется на нескольких уровнях: активация происходит засчёт аутосфосфорилирования, а также засчёт активации экспрессии их генов, пик чего приходит на конец G2 фазы, а очень строго регулируемая деградация происходит с помощью Е3-убиквитин-лигазы APC/C (Анафазного промоторного комплекса/циклосомы), которая обеспечивает убиквитин-опосредованный протеолиз.

После репликации у каждой хроматиды появляется "сестра", с которой хроматида должна быть прочно связана вплоть до анафазы, когда каждая из них не разойдется в дочерние клетки. Очень важно, чтобы эта связь не разорвалась раньше, т.к. в противном случае клетки получат неравноценный генетический материал, что чревато нарушениями их жизнедеятельности. Связывание хроматид друг с другом обеспечивают когезиновые комплексы, состоящие из четырех основных субъединиц: SMC-белков 1 и 3 (Structural Maintenance of Chromosomes), обладающих АТФ-азной активностью, RAD21 (или REC8) и белков STAG (1/2/3). Белки образуют кольца, образующиеся уже с началом S-фазы, охватывающие хроматиды.

Диссоциация же когезиновых комплексов у позвоночных происходит по двум механизмам. Во время профазы "кольца" на плечах хромосом, а если точнее, белки STAG2/SA2 фосфорилируются и диссоциируют под действием Plk1 и киназы Aurora В, в то время как на центромерах когезиновые комплексы остаются нетронутыми. А когда все хромосомы ровно выстроятся на экваторе, будут "би-ориентированы" по отношению к полюсам, тогда станет возможен очередной переход — между метафазой и анафазой. При этом в диссоциации остатков когезина примет участие фермент сепараза, что вызовет деградацию белка RAD21.

Сепараза до момента наступления анафазы находится в комплексе с секурином, который не даёт ей проявлять протеолитическую активность. Затем же, в конце метафазы, под действием APC (циклосомы) сепараза активируется. Активность же самого анафазного промоторного комплекса регулируется несколькими способами (См. Рисунок 8).

Во-первых, что именно будет убиквитинировать APC, решает адапторный белок, связанный с ним. Циклосома, связанная с Cdc20, будет как раз убиквитинировать секурин.

Во-вторых, АРС может быть активирован в результате фосфорилирования с помощью Plk1 или Cyc B/Cdk1. В-третьих, активность циклосомы регулируется сигнальным путём, реагирующим на правильное прикрепление хромосом к веретену деления — так называемой “сверочной точкой сборки веретена деления”, SAC.

Многоступенчатость регуляции требуется для того, чтобы можно было быть уверенным, что эта система протеолиза будет запущена только в нужный клетке момент, т.к. АРС ещё и вызывает деградацию циклина, и деградацию ключевых киназ (Plk, Aurora). Для этого и в течение всей G1 активность циклосомы поддерживается на достаточном уровне, во избежание преждевременного начала деления.

Один из основных путей выхода из митоза это — убиквитин-зависимая деградация с помощью АРС, одного его недостаточно для перехода M/G1.

Достаточно полно изучен этот процесс только у дрожжей, поэтому и описание данного процесса будет основано на них, несмотря на явные различия в протекании деления у них и у многоклеточных животных. Так, деление у них происходит без разрушения ядерной оболочки, а вместо центросом, находящихся на полюсах веретена у животной клетки, у них — полярные тельца веретена, находящиеся рядом с кариолеммой.

Основной фермент, необходимый для дефосфорилирования циклинов и белков, являющихся субстратами циклинов — фосфатаза Cdc14. На протяжении практически всего цикла этот белок находится в ядрышке в неактивном состоянии засчёт связывания со специфическим ингибитором, Net1. И основным путём его активации является MEN (Mitotic Exit Network), являющийся киназным каскадом, итогом которого служит фосфорилирование фосфатазы и выход её в ядро, где она уже дефосфорилирует непосредственно циклины, способствуя их разрушению, субстраты циклинов и потворствует аккумуляции их белков-антагонистов.

Активность свою MEN начинает проявлять тогда, когда концентрация циклинов, особенно комплекса Cyc B/Cdc1 становится достаточно низкой — а она начинает падать практически сразу после вступления клетки в митоз, таким образом, уже в начале анафазы начинается его активация, пика достигающая в конце телофазы.