Мультиплексная ИФА
Иногда требуется проводить иммуноферментный анализ нескольких десятков белков, дабы определить общую картину. Учитывая количество аналитов и длительность ИФА, такой подход не очень удобен и совсем не быстр.
Для решения таких комплексных задач применяют мультиплексный анализ на основе технологий микрочастиц.
В основе технологии — использование полимерных микросфер, несущих на поверхности зонды к определенным молекулам. Микросферы содержат два флуорофора в различных концентрациях, соотношение которых позволяет создавать разные спектральные характеристики у разных микросфер. Каждый тип частиц несет уникальный вид зонда и обладает уникальным спектром. Этот спектр распознается анализатором Luminex
Вестерн-блоттинг
Вестерн-блоттинг (англ. western blot) — еще один метод, в котором с помощью антител ученый может поймать нужный ему белок среди множества других. Последовательность этой «молекулярной рыбалки» очень похожа на ИФА, только «ловля» происходит не в лунке планшета, а на нитроцеллюлозной мембране 
1.Смесь белков (например, лизат клеток или тканей организма) разделяем методом электрофореза (см. статью «12 методов в картинках: очистка молекул и разделение смесей» [14]).
2.Под действием электрического тока переносим белки из геля, в котором проводился электрофорез, на нитроцеллюлозную мембрану. Белки налипают на мембрану и образуют точную реплику того, как они разделились в электрофорезном геле. Такая мембрана с белками на ней и называется блотом.
3.Аналогично ИФА, добавляем к мембране «забивку»
— обезжиренное молоко или БСА, чтобы антитела неспецифически не прилепились к мембране.
4.Добавляем антитела к белку, который мы ищем — Белку Х.
5.Несколько раз тщательно отмываем мембрану от несвязавшихся антител.
6.Добавляем «вторичные антитела» — антитела к антителам к Белку Х, несущие на себе фермент.
7.Еще раз отмываем мембрану от излишков антител.
8.Добавляем субстрат для фермента, чтобы наконец-то увидеть, где же спрятан наш Белок Х, и считываем сигнал.
Иммунохроматография
•— иммунохимический метод анализа, основанный на принципе тонкослойной хроматографии и включающий реакцию между антигеном и соответствующем ему антителом в биологических материалах. Проводится с помощью специальных тест-полосок, панелей или тест- кассет.
•метод обнаружения белка в анализируемой жидкости, в котором сам факт наличия жидкости используется для проведения реакции
1.На мембрану на некотором расстоянии друг от друга нанесены: а) антитела к Белку Х, к которым пришита метка, — так называемые первичные антитела (меткой могут быть окрашенные латексные шарики, коллоидное золото, флуоресцентный белок и т.п.);б) еще одни антитела, специфичные к Белку Х (тестовая полоса) и, наконец, в) антитела к первичным антителам (контрольная полоса).
2.Мембрану погружаем одним концом в исследуемую жидкость, с током которой Белок Х (если он, конечно, присутствует в пробе) передвигается сначала к антителам с меткой, связывается с ними и движется дальше к тестовой полосе.
3.На тестовой полосе комплекс антиген—первичное антитело связывается с присутствующими там антителами, закрепляется и окрашивает ее.
4.Избыток первичных антител, смытый с их места дислокации, движется дальше, к контрольной полосе, где связывается с присутствующими там антителами, останавливается и окрашивает ее.
5.Расшифровка результатов проста: если в анализируемой жидкости есть Белок Х, то на тесте будут видны две полосы, если же белка нет — только контрольная полоса.
Иммуногистохимия
•– это метод локализации специфических антигенов в тканях, основанный на распознавании антигена соответствующим антителом и выявления результатов этого связывания на светооптическом уровне.
•очень часто используется в медицинской диагностике, помогая врачам определить принадлежность опухоли к тому или иному типу и подобрать необходимое лечение. Еще ее часто используют, чтобы диагностировать онкологические и иммунологические заболевания.
1.ткань замораживают или же заключают в парафин. Суть этой подготовки в том, орган тонко нарезают и закрепляют на специальном стекле, на котором будет происходить исследование. Толщина среза при этом должна быть не более 18 микрон
2.производят «забивку» — блокировку неспецифических антигенов, как правило, с помощью бычьего сывороточного альбумина. Когда процесс блокировки завершен, можно приступать к определению тканевых антигенов. Обычно для этого используют поликлональные или моноклональные антитела. Кроме того, иммуногистохимия может проходить в две или одну стадии — с использованием вторичных антител (непрямая иммуногистохимия) или без них (прямая иммуногистохимия).
3.При прямой иммуногистохимии с антигеном на тканисвязываютсяпервичные антитела с флуоресцентной меткой. При непрямой иммуногистохимии флуоресцентную метку на себе несет вторичное антитело, которое связывается с противоположным от ткани концом первичного антитела.
4.После завершения всех процедур используют флуоресцентный микроскоп, чтобы увидеть свечение, если на ткани присутствует антиген.
ChIP-сhip и ChIP-seq
•Эти методы нужны для выяснения, с какими последовательностями ДНК в клетке связываются исследуемые белки (например, гистоны). Методы очень похожи, и отличаются только последним этапом. ChIP расшифровывается как chromatin immunoprecipitation, то есть иммунопреципитация хроматина.
•ChIP-seq — метод анализа ДНК-белковых взаимодействий, основанный на иммунопреципитации хроматина (ChIP) и высокоэффективном секвенировании ДНК.
ChIP-sequencing (СhIP-seq)
1.С помощью обратимой реакции с формальдегидом Белок Х крепко связывается с геномной ДНК. Такое прочное связывание ДНК с белком необходимо для того, чтобы анализировать именно Белок Х, связывающийся с интересующей нас последовательностью. Эту реакцию можно повернуть вспять при помощи нагревания, что мы и сделаем пару шагов спустя.
2.После этого ДНК, уже связанная с Белком Х, расщепляется на фрагменты размером около 1 т.п.н. при помощи ультразвука. Кроме ультразвука иногда могут использовать нуклеазы микрококков, расщепляющие ДНК в случайных местах.
3.Затем проводят иммунопреципитацию Белка Х со специфическими к нему антителами (как — мы уже описали в соответствующем разделе). Эта процедура позволяет отделить фрагменты ДНК, связанные с Белком Х, от других, не интересующих нас в данном исследовании фрагментов ДНК.
4.Как мы уже говорили в п.1, ДНК связывается с белком обратимо. И теперь при помощи нагревания ее открепляют от Белков Х, соединенных с антителами.
5.У нас получились «голые» кусочки ДНК, которые больше не соединены с белками. Осталось выяснить последовательность этих кусочков. Для собственно анализа последовательности ДНК, связывающейся с Белком Х, ее необходимо амплифицировать (то есть приумножить количественно) методом полимеразной цепной реакции.
6.Далее следует уже собственно секвенирование
ChIP-chip (иммунопреципитация
хроматина на чипе)
1.Тщательно обработанные и очищенные одиночные цепи ДНК помечаются флуоресцентной меткой. Флуоресцентная метка — это обычно органический краситель, такой как Cy5 или Alexa 647, светящийся в красной области спектра.
2.Затем фрагменты одиночной цепи ДНК прикрепляются к специальной структуре, называемой ДНК-микрочип [20]. Микрочип представляет из себя подложку, к которой прикреплены короткие одноцепочечные фрагменты геномной ДНК с различными последовательностями нуклеотидов. Когда к микрочипу добавляют помеченные флуоресцентной меткой ДНК, некоторые из них связываются (гибридизуются) с комплементарными одноцепочечными ДНК на микрочипе и участок микрочипа, на котором находится теперь уже двухцепочечная ДНК, начинает светиться.
3.На этом заканчивается часть работы «мокрой» лаборатории и начинается работа биоинформатиков. Биоинформатики считывают световой сигнал с микрочипа и нормализуют его, используя контрольные сигналы от аналогичного первому второго чипа. Затем, используя статистические методы, ученые определяют последовательность нуклеотидов на ДНК, связанной с Белком Х.