Иммуноблот

Аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков.

На первом этапе используют электрофорез белков в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по длине (как правило, в присутствии SDS) или по трехмерной структуре белка (в нативном состоянии). Далее белки переносят на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану, затем детектируют с использованием антител, специфичных к заданному белку

1.Смесь белков (например, лизат клеток или тканей организма) разделяем методом электрофореза (см. статью «12 методов в картинках: очистка молекул и разделение смесей» [14]).

2.Под действием электрического тока переносим белки из геля, в котором проводился электрофорез, на нитроцеллюлозную мембрану. Белки налипают на мембрану и образуют точную реплику того, как они разделились в электрофорезном геле. Такая мембрана с белками на ней и называется блотом.

3.Аналогично ИФА, добавляем к мембране «забивку»

— обезжиренное молоко или БСА, чтобы антитела неспецифически не прилепились к мембране.

4.Добавляем антитела к белку, который мы ищем — Белку Х.

5.Несколько раз тщательно отмываем мембрану от несвязавшихся антител.

6.Добавляем «вторичные антитела» — антитела к антителам к Белку Х, несущие на себе фермент.

7.Еще раз отмываем мембрану от излишков антител.

8.Добавляем субстрат для фермента, чтобы наконец-то увидеть, где же спрятан наш Белок Х, и считываем сигнал.