Методы изучения строения белков
Методы изучения строения белков
3. Диализ
Для отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды используют диализ.
Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе.
Принципы электрофоретического разделения белков
Метод основан на том, что молекулы белка обладают электрическим зарядом, величина и знак которого определяются аминокислотным составом белка, pH и ионной силой окружающей среды. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Скорость перемещения белковых частиц пропорциональна величине их заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации.
Принципы электрофоретического разделения белков
Электрофорез белков крови
Иммуноферментный анализ
Иммуноферментный анализ (ИФА) — один из видов иммунохимического анализа. Он основан на высокоспецифической иммунологической реакции антигена (АГ) с соответствующим антителом (АТ) с образованием иммунного комплекса. При этом один из компонентов конъюгирован с ферментом. В результате реакции фермента с хромогенным субстратом образуется окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически.
Иммуноферментный анализ
ИФА содержит 3 обязательные стадии:
1.Стадия узнавания исследуемого соединения специфическим антителом;
2.Стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;
3.Стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.
Иммуноферментный анализ
Классификация ИФА
1) по типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА:
•В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментом и конкурирующий за центры специфического связывания с ним;
•Для неконкурентных методов характерно присутствие на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.
Иммуноферментный анализ
Классификация ИФА
2) по принципу определения исследуемого вещества:
•Прямое определение концентрации вещества (АГ или АТ). Используют антитела к исследуемому веществу, соединенные со специфической меткой. В этом случае метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу;
•Непрямое определение концентрации вещества – по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.
Иммуноферментный анализ
Классификация ИФА
2) по типу результатов:
•Количественный;
•Полуколичественный;
•Качественный.
