2. Материалы и методы

   1. Определение спектра поглощения красителя, выбор длины волны цитофотометрии. Регулировка длины волны регистрируемого света проводится с помощью 18-ти интерференционных светофильтров, расположенных в двух кольцах у основания ФЭУ. На нижнем кольце расположены фильтры №№1-9, на верхнем – №№10-18. Когда используется фильтр с нижнего кольца – его номер ставится напротив нуля на верхнем кольце. При этом верхнее кольцо повернуто до упора влево. Глядя в окуляр и перемещая объект горизонтально, находится область мазка, где клетки расположены не слишком плотно. С помощью кольца для замены зондов устанавливается зонд на свободное от клеток поле и, последовательно меняя светофильтры, снимается показания милливольтметра. Затем аналогичная работа проделывается, путем установления зонда последовательно на 4-5 клетках рядом со свободным полем.

   2. Вычисляются оптические плотности для каждой клетки, затем определяются средние для каждого светофильтра. Строится спектр поглощения красителя, используя характеристики светофильтров из таблицы на с. 162 учебного пособия.

   3. Выбираются по спектру те светофильтры, которые необходимо использовать для цитофотометрии плаг-методом, одноволновым и двухвольновым методами.

   4. Цитофотометрия клеток тремя методами.

Наблюдая в окуляр области, где клетки расположены не слишком плотно, проводится цитофотометрия эритроцитов тремя методами. Для этого зонд наводится сначала на свободное поле и измеряется интенсивность при выбранных фильтрах и зондах. Затем зонд перемещается на клетку и повторяются все измерения.

5. Определение площади клетки.

Диаметр каждой клетки определяется в единицах барабана окуляр-микрометра. Для этого с помощью винта крест наводится на левый край клетки, отмечаются показания барабана, переводится крест на правый край клетки, снимаются показания барабана снова, а разность показаний заносится в таблицу. Также измеряются значения диаметра всех зондов.

6. После цитофотометрии всех 30-ти клеток объект-микрометр помещается вместо образца на предметный столик, добавляется капля масла, фокусируется изображение вертикальных линий (расстояние между ними указано в мм на самом объект-микрометре). Измеряется расстояние между линиями в единицах барабана, единицы барабана переводятся в мм.

7. Обработка результатов.

Для каждого метода рассчитываются DS каждой клетки, находится среднее значение, стандартное отклонение, относительная погрешность. Рассчитываются площади всех зондов.

3. Результаты

   1. После вычисления значений оптических плотностей для каждого светофильтра был построен график D(λ). Значения длин волн были взяты согласно таблице «Характеристики интерференционных светофильтров (ФМЭЛ-1)».

Диаграмма 1. Спектр поглощения красителя, которым окрашен образец D(λ).

2. Данные, полученные при измерении клеток разными методами, были занесены в таблицу, а затем вычислены необходимые параметры.

Таблица 1. Экспериментальные данные и вычисленные параметры для всех образцов.

	Интенсивность						Диаметр клетки			Площадь клетки S
Фильтр	Фп=Фд1			Фп	Фд1	В единицах барабана		В мм	Как круга, мм2		Методом двух площадей
Зонд	0,1	0,5	1,5	0,5	0,5
Поле	1,21	25	256	74	61	60		0,0060	0,00002826		0,0002004
Кл 1	0,91	15,1	180	41	37	62		0,0062	0,00003018		0,0000335
2	0,43	17,9	223	51	46	57		0,0057	0,00002550		0,0000663
3	0,47	12,3	194	40	35	70		0,0070	0,00003847		0,0002768
4	1,13	18,2	228	45	45	66		0,0066	0,00003419		0,0001399
5	0,95	18,2	210	48	56	62		0,0062	0,00003018		0,0000502
6	0,28	13,7	197	38	39	69		0,0069	0,00003737		0,0001460
7	0,95	13,2	208	43	33	64		0,0064	0,00003215		0,0000461
8	0,85	14,9	235	39	40	62		0,0062	0,00003018		0,0001883
9	1	20,3	206	46	50	66		0,0066	0,00003419		0,0008067
10	1,16	12,2	205	39	37	57		0,0057	0,00002550		0,0000570
11	0,78	15,7	225	48	52	54		0,0054	0,00002289		0,0000692
12	0,73	15,9	214	46	58	61		0,0061	0,00002921		0,0001026
13	0,84	19,2	208	51	50	58		0,0058	0,00002641		0,0001684
14	0,9	18,1	190	46	48	59		0,0059	0,00002733		0,0001306
15	0,78	16,3	185	45	49	68		0,0068	0,00003630		0,0000683
16	0,77	14,6	218	40	43	63		0,0063	0,00003116		0,0002603
17	0,97	13,3	177	43	42	60		0,0060	0,00002826		0,0000527
18	0,7	20,6	222	45	51	57		0,0057	0,00002550		0,0001124
19	0,83	15,8	202	45	40	60		0,0060	0,00002826		0,0002076
20	1,13	23,4	235	48	60	62		0,0062	0,00003018		0,0001126
21	0,95	13,1	219	41	32	64		0,0064	0,00003215		0,0000930
22	0,64	16	189	45	50	49		0,0049	0,00001885		0,0001811
23	0,9	13	185	44	41	62		0,0062	0,00003018		0,0001409
24	0,89	13,1	199	44	34	70		0,0070	0,00003847		0,0001518
25	0,84	15,8	185	41	48	60		0,0060	0,00002826		0,0000714
26	0,8	17,4	219	47	49	69		0,0069	0,00003737		0,0001510
27	0,88	14,5	193	41	39	63		0,0063	0,00003116		0,0005536
28	1,14	19,3	207	46	49	56		0,0056	0,00002462		0,0000486
29	0,64	18,7	221	52	53	53		0,0053	0,00002205		0,0000748
30	0,84	17,7	221	50	52	60		0,0060	0,00002826		0,0002004

Таблица 2. Экспериментальные данные и вычисленные параметры для всех образцов.

D			DS
П	О	Д	П	О	Д
0,12374	0,25645	0,86612	0,000024793	0,0000072472	0,0000244766
0,44932	0,16166	0,23566	0,000015035	0,0000048782	0,0000071110
0,41069	0,26717	0,37818	0,000027214	0,0000068141	0,0000096453
0,02971	0,21602	0,38998	0,000008223	0,0000083092	0,0000150007
0,10506	0,18799	0,02270	0,000014701	0,0000064283	0,0000007764
0,63563	0,28945	0,28806	0,000031893	0,0000087342	0,0000086922
0,10506	0,23576	0,73145	0,000015340	0,0000088114	0,0000273369
0,15337	0,27817	0,31684	0,000007076	0,0000089441	0,0000101875
0,08279	0,20647	0,25824	0,000015589	0,0000062304	0,0000077926
0,01833	0,27817	0,29337	0,000014785	0,0000095118	0,0000100315
0,19069	0,18799	0,05157	0,000010873	0,0000047946	0,0000013153
0,21946	0,20647	0,00734	0,000015188	0,0000047263	0,0000001680
0,15851	0,16166	0,13720	0,000016263	0,0000047221	0,0000040075
0,12854	0,20647	0,16025	0,000021645	0,0000054524	0,0000042318
0,19069	0,21602	0,09715	0,000024902	0,0000059029	0,0000026546
0,19629	0,26717	0,19371	0,000013408	0,0000096979	0,0000070312
0,09601	0,23576	0,18711	0,000024996	0,0000073456	0,0000058297
0,23769	0,21602	0,20052	0,000012532	0,0000061047	0,0000056666
0,16371	0,21602	0,42946	0,000018399	0,0000055095	0,0000109531
0,02971	0,18799	0,00399	0,000006167	0,0000053126	0,0000001127
0,10506	0,25645	1,38330	0,000011825	0,0000077384	0,0000417417
0,27661	0,21602	0,07846	0,000025715	0,0000069458	0,0000025227
0,12854	0,22578	0,20399	0,000023284	0,0000042554	0,0000038448
0,13340	0,22578	0,53741	0,000018793	0,0000068130	0,0000162165
0,15851	0,25645	0,10811	0,000024056	0,0000098643	0,0000041584
0,17970	0,19713	0,11394	0,000012826	0,0000055710	0,0000032199
0,13830	0,25645	0,33832	0,000020882	0,0000095844	0,0000126443
0,02588	0,20647	0,18680	0,000014328	0,0000064330	0,0000058202
0,27661	0,15323	0,05932	0,000013433	0,0000037721	0,0000014602
0,15851	0,17026	0,06475	0,000011859	0,0000037544	0,0000014279
0,12374	0,25645	0,86612	0,000024793	0,0000072472	0,0000244766

Таблица 3. Средние значения и значения относительных погрешностей для трех методов

	П	О	Д
Среднее значение	0,000017201	0,000006674	0,000008536
Стандартное отклонение	0,000006421	0,000001846	0,000009099

4. ВЫВОДЫ

   1. Средние оптические плотности клетки, определенные тремя методами, различаются в значительной степени. Это можно связать с тем, что клетка неоднородна по своей форме и плотности (особенно если иметь ввиду, что эритроцит — двояковогнутая клетка), а также с тем, что измерения проводились в одной точке, что существенно снижает качество измерений (возможно, для данного типа клеток лучше использовать многоточечный метод, при котором D определяется как среднее из нескольких измерений в различных частях клетки). Также надо учитывать, что все методы дают погрешность, что влияет на полученные значения.

   2. После проведения измерений тремя методами было выявлено, что наименьшую относительную погрешность дал одноволновой метод (0,000001971 при среднем значении 0,000006674) — это можно связать с тем, что для работы им необходимо небольшое количество параметров. Чуть более высокая погрешность оказалась у плаг-метода (0,000006421 при среднем значении 0,000017201), а самая большая погрешность – у двухволнового (0,000010067 при среднем значении 0,000008536). В целом нужно отметить, что значения погрешностей довольно высоки и не соотносятся с теоретическими данными (в теории, самая маленькая погрешность должна быть у двуволнового метода). Скорее всего, это происходит из-за последовательного накопления ошибок в измерениях и вычислениях (некоторые параметры рассчитываются косвенно, а не измеряются прямо), на которых они основаны. Кроме того, можно связать получение столь спорных данных с перебоями в работе милливольтметра, выцветанием препарата и др.

   3. Площади клетки, полученные методом двух площадей и через площадь круга, отличаются. Это особенно хорошо видно, если сравнить среднее значение, найденное через площадь круга (0,00002983) и методом двух площадей (0,0001587) – они отличаются больше, чем в 5 раз. Более правильным будет принять площадь клетки равной площади зонда – 0,5, так как именно такая площадь соответствует реальному размеру клетки (в единицах барабана это значение будет равняться примерно 50 единицам), хотя в таком случае нужно учитывать и погрешность, которая появляется при измерении этим зондом.

   4. Максимум поглощения красителя на мазке находится в интервале 523-551 нм. Согласно полученным данным максимальное значение наблюдается на волне длиной 523 нм. Но очень близкое значение D есть и на волне длиной 551 нм. Согласно графику между ними наблюдается небольшой «провал» на волне длиной 534 нм. Возможно, максимум, на самом деле, принадлежит именно этой длине волны, но из-за неточности измерений был вынужден «сдвинуться» (это, к слову, могло отразиться и на последующей работе, так как светофильтр для измерения плаг-методом выбирается как на основе поиска максимального значения D).