Александров Ю.И., Анохин К.В. - Нейрон. Обработка сигналов. Пластичность. Моделирование_ Фундаментальное руководство (2008)

Глава 3. ПАМЯТЬ ДОНЕРВНЫХ ОРГАНИЗМОВ

(о физиологических механизмах поведения простейших)

Анализ работ, посвященных изучению приобретенных форм поведения у беспозвоночных, позволяет сделать заключение о том, что способность к накоплению индивидуального опыта появляется в эволюции на самых ранних ступенях развития — у донервных простейших организмов. Однако функциональные механизмы, определяющие поведение беспозвоночных животных разного уровня филогенеза, различны. У донервных организмов формирование приобретенного поведения осуществляется за счет макромолекулярных и ультраструктурных перестроек. Обнаружена зависимость привыкания от возраста инфузорий и состояния их ядерного аппарата. В эволюционном плане весьма существенно, что характер этих перестроек однозначен у животных разного уровня филогенеза, обладающих различными функциональными механизмами приобретенного поведения. Основные закономерности функциональных механизмов поведения беспозвоночных являются по существу филогенетическим отражением принципа единства структуры и функции.

3.1. Об условных рефлексах простейших

Одной из характерных особенностей современной биологии является все возрастающий интерес к изучению поведения животных. По сравнению с позвоночными животными, закономерности формирования поведения беспозвоночных значительно менее изучены. Причем сказанное относится прежде всего к изучению их высшей нервной деятельности. Значительное отставание в изучении функциональных механизмов приобретенного поведения у беспозвоночных животных, на наш взгляд, может быть объяснено, по крайней мере, тремя основными причинами. Во-первых, трудностью содержания многих животных в лабораторных условиях; во-вторых, трудностью создания адекватных методик исследования и методов объективной регистрации поведения; в-третьих, тем, что физиологи, занимающиеся исследованием поведения беспозвоночных, далеко не всегда обладают знаниями, позволяющими свободно выбирать необходимые для изучения объекты (Тушмалова, 1973). Заметим сразу, что в филогенетическом ряду беспозвоноч- ных наиболее изученными оказались насекомые и моллюски по

60

сравнению с более «простыми» организмами. Так, для моллюсков и насекомых наиболее актуальной задачей является определение степени сложности механизмов приобретенного поведения, в то время как для низших беспозвоночных необходимо вновь и вновь доказывать, что они способны к накоплению индивидуального опыта — обучению.

Рассмотрение оригинальных экспериментальных исследований, посвященных выработке у простейших условных рефлексов, убеждает

âчрезвычайно разноречивой трактовке результатов. Обзору таких работ посвящен ряд публикаций, отражающих взгляды биологов зоологи- ческого и физиологического профилей (Коган, 1963; Воронин и др., 1967; Серавин, 1969, 1978; Hamilton. 1975; Тушмалова, 1980). Исследователи, иллюстрирующие возможность выработки условных рефлексов у простейших, чаще всего останавливаются на опытах Н. Н. Тимофеева (1958) и серии работ Гельбера (Gelber, 1956, 1958). Рассмотрим детально эти эксперименты, чтобы показать, что их результаты могут иметь иное объяснение, если учесть некоторые особенности ресничных инфузорий. Н. Н. Тимофеев проводил опыты на инфузориях в камере размером 10x4 мм, разделенной пополам, в каждой из половин были вмонтированы платиновые электроды. Условным раздражителем служил свет, безусловным — электрический ток (50 Гц 1–2 В). Выработка условного рефлекса заключалась в том, что инфузории «учились» только

âответ на изолированное действие света не заплывать в ту часть камеры, где давался удар электрического тока. Объясняя результаты опытов, автор акцентирует внимание на двигательных реакциях инфузорий, считая, что выработка условных реакций определяется «количе- ством, а возможно, и качеством самой двигательной активности», не раскрывая этого понятия. Однако опыты Н. Н. Тимофеева можно объяснить, исключая возможность формирования временных связей. Известно, что многие инфузории в ответ на различные вредные воздействия внешней среды выстреливают трихоцисты. Эту реакцию можно классифицировать как врожденную, безусловно оборонительную — сигнал «опасности» для других особей. В опытах Н. Н. Тимофеева таким «оборонительным» раздражителем был электрический ток. Формирование «условного рефлекса» во времени (постепенность выработки) на самом деле может быть следствием постепенного диффундирования относительно небольшого количества трихоцист по объему камеры. Экспериментально показано, что выстреливание трихоцист происходит в ответ на непосредственное действие различных кислот, щелочей, механических воздействий электрического тока (Prosser, Brown, 1967).

61

Таким образом, результаты опытов Н. Н. Тимофеева не могут служить доказательством способности простейших вырабатывать условные рефлексы.

Часто как доказательство выработки у простейших условных рефлексов приводят серию работ Гельбера по выработке у инфузорий Paramecium aurelia пищевых условных рефлексов. В связи с принципиальной важностью физиологической оценки этих работ в плане обсуждаемой проблемы, остановимся подробно на рассмотрении результатов этих работ. Опыты проводились следующим образом. Стерильная платиновая проволока длиной 7,6 см с диаметром кончика 0,5 мм располагалась в середине стеклянной экспериментальной лунки под углом 85° к горизонтали. Поднимание и опускание проволоки осуществлялось с помощью специального рубильника. В контрольных экспериментах было показано, что погружение проволоки в нативную культуру на 3 мин. приводит к скоплению на ней 1–2 инфузорий. При обучении проволоку опускали в лунку с голодными инфузориями на 15 с. синтервалами в 25 с. (время отсчитывали фотографическим хронометром).

Каждое третье опускание проволоки подкреплялось пищей (опускалась проволока с нанесенными бактериями). В контрольных экспериментах не было обнаружено изменений в количестве животных, что исключило возможное объяснение увеличения числа животных у проволоки за счет простого изменения двигательной активности инфузорий.

Однако в этой работе не обнаружено воздействия обучения с подкреплением, что, по мнению автора, может быть объяснено слабой или замедленной реакцией животных на эффект опускания проволоки. Хотя такое объяснение автора и не лишено основания, более вероятной при- чиной нам кажется нарушение процедуры выработки условных рефлексов: слишком большие интервалы между сочетаниями (оптимальные условия частоты вообще специально не изучались) и непериодич- ность подкрепления (лишь третье предъявление иглы сочеталось с пищей).

В дальнейшем Гельбером было показано, что выработанная реакция инфузорий — прилипание «дрессированных» животных к стерильной проволоке — сохраняется до З часов.

Был продемонстрирован эффект, аналогичный угасанию, у трех групп культур P. aurelia, обученных по описанной методике. Через 2 часа проверялось сохранение обучения. Группы перед началом проверки

62

получили разное количество испытаний без подкрепления: группа 1 — 10 испытаний, группа 2 — 5, группа 3 — не получала совсем. Оказалось, что через 2 часа после дачи проб группа 3 показала количество ответов, превышающее остальные группы. Группы без обучения (контрольные) дали «нулевые» ответы. Эти опыты, без сомнения, подтверждают пластичность поведения инфузорий. Однако они, как и предыдущие эксперименты автора, не дают (в силу особенностей используемой методики) ответа на природу физиологических механизмов, лежащих в основе наблюдаемого явления. Отмеченное угасание на самом деле могло развиваться по механизму привыкания к отсутствию пищевого раздражителя, что исключает условнорефлекторную природу явления.

В этой связи заслуживают внимания опыты Катца и Детерлайна (Katz, Deterline, 1958), которые использовали методику Гельбера с дополнительными контрольными экспериментами и показали, что после перемешивания жидкости в лунке с бактериями «дрессированные» бактерии не оседают на поверхности стерильной проволоки на дне лунки. В другом опыте авторы на дно лунки с голодными парамециями вносили с помощью платиновой проволоки небольшое количество бактерий. Повторив методику выработки условных рефлексов у инфузорий P. aurelia, они использовали только стерильную платиновую проволоку. Результаты достоверно опровергали опыты Гельбера: были получены такие же данные, как и в случае с проволокой, покрытой предварительно бактериями (инфузории без «обучения» собирались на поверхности стерильной проволоки).

Таким образом, результаты опытов Гельбера, на наш взгляд, могут свидетельствовать лишь о способности инфузорий четко реагировать на пищевое раздражение или, возможно, на изменение среды, вызванное присутствием бактерий.

3.2.Привыкание простейших

Óорганизмов, лишенных нервной системы, могут быть более простые (неусловнорефлекторные) формы приспособительного поведения. Примером элементарного механизма накопления индивидуального опыта служит привыкание (Thorp, 1964). Под привыканием понимают прекращение реакции на постоянно действующий биологический раздражитель. Л. Г. Воронин (1968, 1969, 1972) относит привыкание простейших к несигнальной форме индивидуального приспособления. К одной из первых работ по выработке привыкания у простейших принадлежат опыты Данича (Danisch, 1921) на сувойках (Vortioella

63

nebulivera). Автор исследовал привыкание к механическому раздражению у инфузорий. Критерием привыкания служило прекращение сокращения стебелька сувойки в ответ на раздражение. О динамике привыкания судили по количеству сокращений, необходимых для отсутствия сокращения. В работе получена зависимость скорости выработки привыкания от силы механического раздражения: привыкание вырабатывалось тем быстрее, чем меньше была сила используемого механи- ческого раздражителя.

Позднее закономерности привыкания у простейших изучал Кинастовский. Им было подробно изучено влияние механического раздражения на сокращение инфузорий (Kinastowski, 1963). Автор в качестве механических раздражителей использовал свободно капающую каплю и специальный прибор, вызывающий вибрацию экспериментального сосуда. Оказалось, что оптимальными условиями для развития привыкания служит сила раздражителя от 400 до 1 600 эрг, частотой 10 и 15 раз/мин. Раздражение с большей силой (20 000 эрг) не приводит к уменьшению числа сокращений, а может вызывать судорожное состояние и летальный исход. Действие раздражителя оптимальной силы с частотой 1 раз в 1 мин. не снижало числа сокращений во времени. Полное прекращение реакций в ответ на механическое раздражение в оптимальных условиях опыта наступало через 13–20 мин.

В опытах Кинастовского животные с выработанным привыканием отвечали на сигнал другой модальности и на сигнал этой же модальности, но большей силы, что отличало полученный феномен от утомления. В аспекте рассматриваемых работ представляют интерес опыты А. Б. Когана (1963, 1964) на сувойках. Была показана способность этих инфузорий сокращаться в ответ на механическое раздражение — падение на предметный столик маленького свинцового шарика с высоты 3 см. Оказалось, что если к телу сувойки подвести стеклянную палоч- ку так, чтобы выпрямление стебелька осуществлялось только на 3/4 его длины, то инфузории могут изменять свое поведение (замедление выпрямления стебелька, сокращение длины при выпрямлении) и, что особенно важно, сохранять эти изменения некоторое время после прекращения раздражения — удаления палочки. Автор опытов называет такую форму поведения своеобразной приспособительной реакцией. Отсутствие условного сигнала делает невозможным предположение об условнорефлекторном механизме формирования следовых реакций в этом случае. Можно предположить, что у сувоек вырабатывалось привыкание к модифицированному сокращению.

64

Влияние различных факторов на выработку привыкания у инфузорий спиростом исследовал Аппельвайт (Applewhite, Morowitz, 1967; Applewhite, 1968; Applewhite, Stuart, 1969). В опытах Аппельвайта изучалось привыкание к вибрационному раздражению на популяциях из 60–100 инфузорий. Вибрационный раздражитель подавался каждые 4 с. (падение груза с силой в 70 условных единиц). Критерием привыкания служило отсутствие сокращений на три раздражения подряд (использовалась фоторегисграция). Сохранение выработанного привыкания проверялось через 15 и 30 сек. после окончания опытов. В процессе опытов выявилась зависимость привыкания от температуры: при проверке сохранения привыкания через 15, 30, 60 и 90 сек. при температурах +15, +25 и +37°С оказалось, что более быстрое забывание (больший процент сократившихся инфузорий) наблюдается при температуре 37°С.

Известно, что среда культивирования простейших может оказывать влияние на некоторые показатели функционального состояния животных (биение ресничек, изменение вязкости протоплазмы и т. п.). Поэтому особый интерес представляют эксперименты Аппельвайта и сотрудников (Applewhite et al., 1969) по изучению влияния на привыкание ионов металлов. Оказалось, что предварительное 15-минутное содержание инфузорий в растворе хлоридов калия и натрия (в концентрации от 0,5 до 0,005 моль/л), а также кальция, магния и марганца (в концентрации от 0,25 до 0,002 моль/л) не повлияло на выработку и сохранение привыкания, а воздействие ионов магния оказалось ярко выраженным. В этих опытах о динамике привыкания судили по первой, средней и последней парам раздражений, сохранение проверялось через 30 и 120 с после воздействия последнего раздражения. Двигательная активность «магниевых» инфузорий при этом не изменялась. Одним из предполагаемых механизмов влияния магния на привыкание авторы считают активирование эти ионом некоторых энзимов.

Интересные данные получены Аппельвайтом и соавторами (Applewhite et al., 1969) при изучении клеточной локализации феномена привыкания. После выработки привыкания животных разрезали пополам и вновь отдельно обучали переднюю и задние части. Оказалось, что для принятого критерия выработки (отсутствие реакции до трех нулей подряд) понадобилось примерно одинаковое число механи- ческих стимулов. Анализ полученных фактов позволяет согласиться с мнением авторов работы о том, что привыкание не является следствием утомления, повреждения или местной адаптации.

65

Изучение роли макронуклеуса в процессе привыкания продемонстрировало отсутствие различий в динамике выработки этой реакции у половинок инфузорий, содержащих ядро и лишенных его, что позволило автору высказать предположение о локализации памяти клетки в цитоплазме.

Оценивая серию работ Аппельвайта и сотрудников по изучению привыкания у ресничных инфузорий, необходимо отметить, что они вырабатывали нестойкие реакции (отсутствие реакции на три последовательных стимула), которые при оценке динамики выработки могут быть определены как первые признаки формирования привыкания, но не как прочно выработанная реакция.

Основные закономерности выработки привыкания у Stentor coeruleus были изучены Вудом (Wood, 1970, 1972). У животных вырабатывалось привыкание к механическому раздражению. При постоянной частоте раздражения увеличение силы сигнала замедляло скорость выработки привыкания: в опытах с постоянной силой тока привыкание вырабатывалось тем медленнее, чем реже давался сигнал; при очень сильных раздражениях привыкание не вырабатывалось совсем. Следы привыкания в виде снижения частоты ответов на механические стимулы сохранялись в течение 3 часов.

Несомненным достоинством опытов Вуда служит использование им теста на «растормаживание» как одного из существенных показателей наличия или отсутствия обучения в такой элементарной форме, каким является привыкание. Оказалось, что привыкание, выработанное на механический стимул с силой в 0,04 усл. ед., не растормаживается после однократного раздражения большей силы (0,12 усл. ед.) или после подпорогового раздражения электрическим током. По мнению автора, неспособность к растормаживанию служит единственным отличием свойств привыкания одноклеточных организмов от высших животных.

Оригинальную форму обучения у стентора наблюдали Беннет и Френсис (Bennet, Francis, 1972). Критерием обучения служило сокращение времени передвижения стентора в капиллярной трубке, соединенной с относительно большим резервуаром, наполненным водой. При повторении проб с частотой один раз в 60 сек. время сокращалось от 58 сек. в первой пробе до 31 сек. в третьей. Реакция сохранялась примерно на одном уровне в течение 30 мин. Было показано также, что обучение происходит лишь при строгом соблюдении определенных условий опыта — вертикальном расположении капиллярных трубок с внутренним диаметром не более 0,5 мм. В трубках с диаметром 1 и 2 мм

66

обучения не происходило. Авторы приходят к выводу о том, что изученный вид обучения есть не что иное, как результат привыкания стентора к механическому стимулу. Знакомство с экспериментами Беннета и Френсиса позволяет нам подобное объяснение считать справедливым.

Итак, приведенный материал показывает, что одноклеточные организмы обладают свойством изменять поведение под влиянием различ- ных раздражителей. Эти изменения сохраняются в течение 30–60 мин., а иногда до 3 часов. Сохранение следов от раздражений свидетельствует о способности простейших к накоплению индивидуального опыта.

Наиболее детально вопрос о характерных особенностях функциональных механизмов, определяющих поведение простейших, был исследован в серии работ Н. А. Тушмаловой с сотрудниками (Тушмалова, 1968, 1974, 1977; Тушмалова, Доронин, 1971; Доронин, 1974; Тушмалова, Зазулина, 1977; Доронин, Тушмалова, 1978; Тушмалова, Кузьмичева, 1979). Приступая к изучению привыкания у донервных животных на примере привыкания Spirostomum ambigaum к вибрационному раздражению, авторы поставили своей целью прежде всего ответить на вопрос: в какой степени привыкание простейших соответствует понятию приобретенное поведение, выработанному в опытах на позвоночных животных и высших беспозвоночных. Были изучены такие свойства привыкания, как тренированность, растормаживание, информационная значимость интервалов между раздражениями, зависимость выработки этого феномена от исходного функционального состояния и возраста животных. По динамике реакции привыкания всех животных можно отнести к двум группам. В первой группе привыкание было относительным и заключалось лишь в уменьшении числа сокращений в единицу времени. Во второй группе животных реакция была абсолютной: в ответ на раздражение сокращения отсутствовали. Первое проявление привыкания отмечено после 1–10 мин; отсутствие сокращений до 10 нулей подряд — после 13–47 мин. Как показал анализ экспериментальных данных, оптимальными следует считать сигналы, действующие через промежутки времени, сравнимые с рефрактерными периодами (около 5 сек.), а по силе — с порогом сокращения инфузорий. Быстрее всего привыкание развивается при действии сигнала через 7 сек. При увеличении интервала между раздражениями увеличивается время, необходимое для достижения 100%-ного угашения реакции. Однако реакция вырабатывалась и при сигнале, действующем значительно реже — через 1 мин.: в этих случаях феномен развивался значительно медленнее.

67

Привыкание вырабатывалось и при раздражении 1–9 раз в минуту. Однако для достижения критерия 10 нулей требовалось значительно больше времени (до 50 мин). Наиболее четко значение временного интервала в динамике выработки привыкания было продемонстрировано в опытах с применением раздражителей в аритмическом режиме, по случайному закону, отмечалось замедление в выработке привыкания при аритмическом режиме раздражения. Как и у более высокоорганизованных животных, у инфузорий были выявлены индивидуальные отличия в динамике привыкания (рис. 3.1). У животных с выработанным привыканием в 100% сохранялась реакция на сигнал другой модальности и более сильный сигнал этой же модальности, что отличает изучаемый феномен от утомления. Условия, при которых наблюдалось утомление инфузорий, резко отличались от условий выработки привыкания. Нереагирование на сигнал любой силы и частоты — утомление — развивалось в результате длительной стимуляции инфузорий до 3–4 часов с частотой раздражения 1 раз в 1 сек. и силой, превышающей пороговую в 4–5 раз.

При изучении ультраструктурных изменений инфузорий в процессе привыкания также обнаружены разнонаправленные сдвиги при привыкании и утомлении в ядрышке макронуклеуса. Так, привыкание сопровождалось активацией ядрышка — увеличением синтеза рибосомной РНК. При утомлении наблюдалось резкое снижение синтеза рибосомной РНК.

Анализ результатов показал, что привыкание к вибрационному раздражителю может быть отнесено к категории явлений, характеризующих следовые процессы, т. е. к памяти. Неясным оставался вопрос о том, в какой степени следовые явления одноклеточных обладают свойствами, общими с другими, более высокоорганизованными животными. Одним из критериев приобретенности (выработанности) реакции служит способность к растормаживанию. Использование приема растормаживания привыкания показало, что эта реакция никогда не восстанавливается при действии экстренных раздражителей, более слабых, чем агент, на который было выработано привыкание. При действии же раздражителей большей силы, чем индифферентный, растормаживание носило случайный характер. Воздействия стимулами другой модальности (электрический ток, культуральная среда, насыщенная кислородом или углекислотой) не дали положительных результатов. Эффект растормаживания привыкания был отмечен лишь при действии очень сильного раздражителя — пищевого, т. е. при внесении в камеру с инфузориями капли бактериальной суспензии.

68

Для выяснения вопроса, какой же из факторов (рН среды или непосредственно бактерии) является действующим, в контрольных экспериментах в камеру вносили каплю прокипяченной суспензии, либо фильтрат суспензии бактерий, либо чистый подщелоченный культуральный раствор. Статистически достоверное растормаживание наблюдалось только при использовании капли культуральной среды повышенной щелочности (рН > 8).

Ðèñ. 3.1. Динамика выработки привыкания у отдельных инфузорий. По оси ординат — время, мин.; по оси абсцисс — номера инфузорий. Обозначения: светлые столбцы диаграмм — время, необходимое для достижения одного нуля, с сетчатой штриховкой — трех, с косой штриховкой — пяти и черные — десяти нулей (по: Тушмалова, 1972).

Помимо растормаживания, важным критерием способности животных формировать следовые реакции является ускорение обучения при неоднократном повторении процедуры обучения — тренированность. У популяции инфузорий привыкание вырабатывалось в течение 20 мин., затем инфузории отсаживались в часовое стекло с культуральной жидкостью. Через 60 мин. клетки вновь подвергались воздействию вибрационного раздражителя. Процедура повторялась 5–6 раз. Анализ полученных данных показал, что при первом применении раздражителей (первый опыт) уровень ответов снижается до 35–40%. По мере повторения опытов достоверно уменьшается вероятность сокращения только на первые раздражители. При 5-й и 6-й повторностях инфузории реагируют на механический стимул с вероятностью, которая не отличается (Р > = 0,9) от уровня ответов в конце первого опыта. Таким образом, процесс трени-

69