Пищевая Биохимия / Казаков Е.Д., Карпиленко Г.П. - Биохимия зерна и хлебопродуктов

ГЛАВА2

Глобулярные белки — растворимые вещества с компактной третичной структурой. К глобулярным относится большин- ство белков, содержащихся в растениях, животных и микро- организмах. По форме они приближаются к шару или эллип- соиду. Для их характеристики применяют отношение длины большой оси молекулы к малой оси а/b, для примера приве- дем для некоторых из них эти величины.

Форма некоторых глобулярных белков может значительно отличаться от шаровидной и напоминать вытянутые иглы или короткие нити.

Фибриллярные белки имеют нитевидную форму. Они обыч- но нерастворимы. Выполняют защитные функции. К ним от- носят: кератин, содержащийся в волосах, рогах и копытах жи- вотных; миозин мускулов; фиброин шелка и т. д.

Четвертичная структура. Молекулы многих белков состоят из мономеров, образованных отдельными полипептидными цепя- ми. Ассоциация нескольких мономеров, их взаимное простран- ственное расположение в единой сложной молекуле составля- ют четвертичную структуру белка. Четвертичную структуру создают водородные связи, электростатическое взаимодействие разноименно заряженных групп, ван-дер-ваальсово взаимодей- ствие боковых радикалов аминокислот и др.

Во второй половине 20 века расширены наши знания о фак- торах, кодирующих и стабилизирующих специфические осо- бенности пространственной структуры белков имеющих огром- ную молекулярную массу от 500 тыс. до нескольких миллионов.

Сложный механизм взаимодействия этих факторов составляют понятие и метод, называемый по-английски Folding (фолдинг), переводимый на русский язык «свертывание».

Объединение частей и, прежде всего аминокислот, свер- тывание их в единое белковое целое, регулируется многими физико-химическими процессами на каждом этапе про- странственного формирования белка. Особый интерес и осо-

62

__________________________________________БЕЛКОВЫЕВЕЩЕСТВА

особую роль в этих действиях играют аминокислоты, их после-довательность связывания и разнообразные формы простран-ственного структурирования, начиная с первых моментов по-явления длиннейших углеродных цепей.

Изменения в том же направлении сопровождают все другие уровни синтеза бел-ков. Вся совокупность пространственных структурных построений зa весь период образования каждого белка порождает его своеобразие и особые свойства. На международном симпозиуме, посвященном структуре, стабилизации и фолдингу, прошедшему в Российской Академии Наук в 1998 г., пока-зано, что своеобразие и особые свойства каждого белка риводят к тому, что одни из них могут вызвать неожидан-ные болезни человека, а

другие способны стать средством выдающегося лечебного эффекта.

§ 7. СВОЙСТВА БЕЛКОВ

Белковые вещества дают ряд характерных реакций. Рассмот-

ренные ранее реакции аминокислот характерны также и для белков.

Белки представляют собой амфотерные электролиты (амфолиты). Для них характерна изоэлектрическая точка — величина рН, при которой белок как кислота или как основание имеет наименьшую степень диссоциации. В изоэлектрической точке суммарный заряд молекулы равен нулю, что для глико-

кола можно выразить формулой CH2(NH3)+COO-.

В этой точке растворимость белка наименьшая. Этим пользуются для выделения белков из растворов. Высаливание белков из растворов солями легче всего происходит в изо- электрической точке.

Изоэлектрическая точка находится для глиадина пшени- цы при рН 7,1, а для зеина кукурузы при рН 6,2. Белки облада- ют гидрофильными свойствами, т. е. связываютводу.

При набухании образуют студни или гели. Сильно гидра- тированный гель— пшеничная клейковина, содержащая око- ло 2/3 воды. Гидрофильность белков зависит от гидрофиль- ных групп, расположенных на поверхности белковой глобулы притягивающих к себе дипольные молекулы воды. К ним относится пептидная связь —СО—NH— (связывает одну мо-

ГЛАВА 2

лекулу воды), аминная группа —NH2 (одну молекулу воды), карбоксильная группа —СООН (четыре молекулы) и т. д.

Вблизи поверхности белковой молекулы молекулы воды строго ориентированы, а по мере удаления от нее их располо- жение становится все более беспорядочным. Водная оболоч- ка вокруг белковой молекулы препятствует осаждению белка, повышает устойчивость белковых растворов. Обезвоживание

белковых глобул с помощью органических растворителей (спирта, ацетона) и солей (снижение их гидрофильности) при- водит к тому, что, слипаясь, они образуют крупные частицы и выпадают из раствора в виде осадка. Гидрофильные свойства

белков зерна имеют большое значение при хранении и переработке зерна, при выпечке хлеба, производстве макарон и т. д. Различная гидрофильность белков — один из важных признаков зерна сильной и слабой пшеницы.

То или иное расположение атомов в молекуле белка назы- вают конформацией. Конформацию белков, создающуюся при нормальных физиологических условиях ковалентными и до- полнительными связями, которые придают белковой молеку- ле определенную упорядоченность, компактность и геомет- рическую форму, называют нативной.

Денатурация белков — сложное явление, в основе которо- го лежит изменение вторичной, третичной и четвертичной

структуры белковой молекулы при сохранении первичной структуры. Она обусловлена нарушением кооперативной си- стемы нековалентных взаимодействий (водородных связей, гидрофобных взаимодействий). В результате утрачивается уникальное пространственное расположение и форма поли- пептидных цепочек, нарушается нативная конформация бел- ковой молекулы. Химический состав при денатурации оста- ется без изменения. Схематически денатурацию белка можно представить как развертывание определенным образом уло- женной в пространстве полипептидной цепочки и образова- ние беспорядочного клубка (рис. 9).

Денатурация в большинстве случаев — процесс необрати- мый, однако известны случаи обратимой денатурации белков.

Денатурация изменяет первоначальные свойства белковых веществ: увеличивается реактивность некоторых химических

_________________________________________БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

Рис. 9. Схема денатурации белковой молекулы:

а— исходное положение; б — начинающееся, обратимое развертывание; в — далеко зашедшее, необратимое развертывание полипептидной цепочки

групп, входящих в состав молекулы; появляются свободные группы (—SH и др.); уменьшаются растворимость, гидрофиль- ность, ферментативная активность; изменяется форма или величина белковой молекулы, увеличивается ее асимметрия; облегчается воздействие протеолитических ферментов; изменяется заряд частиц и т. д.

О том, насколько глубоко изменяется белковое вещество в результате денатурации, можно судить лишь по совокупности признаков. Денатурирующие воздействия разделяют на химические, физические и биологические, хотя часто многие из них действуют взаимосвязанно.

К химическим агентам денатурации относят вещества, рез- ко изменяющие величину рН (кислоты, щелочи), органиче- ские вещества и растворители (мочевина, соли гуанидина, уре- тан, спирт, ацетон), детергенты (додецилсульфат натрия), салицилат натрия и др. Из физических агентов необходимо назвать, прежде всего, тепловую денатурацию, т. е. действие высоких температур. Нагрев разрывает водородные связи и на- рушает взаимодействие гидрофобных групп. Тепловая дена- турация белков наиболее часто наблюдается при сушке зерна, если она ведется с нарушением установленных правил, а так-

_________________________________________БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

зателей качества зерна. На этой стадии денатурации свойства белков изменяются незначительно, на хлебопекарных каче- ствах зерна это не отражается.

Третья стадия приводит к укреплению клейковины пшени- цы. Ее широко используют для улучшения физических свойств слабой клейковины.

Отличительные признаки четвертой стадии — далеко за- шедшее укрепление клейковины, которая становится кроша- щейся или совсем не отмывается, хлебопекарные качества муки заметно ухудшаются. Кроме нагрева, денатурирующее воздействие на белки зерна оказывает облучение ультрафио- летовым светом, а также большими дозами рентгеновских и у-лучей.

Белки денатурируются при механических воздействиях, высоком давлении — 500-1000 МПа, растирании сухих пре- паратов, энергичном встряхивании растворов и растекании с образованием поверхностной пленки. Денатурация при рас- текании объясняется тем, что на поверхности раздела возни- кает монослой белка, в котором полипептидные цепи развер- тываются. К механическим денатурирующим воздействиям относят воздействие ультразвука. Некоторые белковые об- разования подвержены денатурации при замораживании (ли- попротеиды). Существенные изменения происходят в белках (и других веществах) зерна морозобойного.

§ 8. КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ

Рациональной химической классификации белков пока не существует. В основу наиболее распространенной системы классификации положены два принципа: степень сложности и характер растворимости. По сложности строения белки раз- деляют на две большие группы — протеины (простые белки) и протеиды (сложные белки). Часть азота входит в состав небел- ковых соединений.

Протеины — белки, дающие при гидролитическом расщеп- лении только аминокислоты. Это запасные, скелетные (опор- ные) и ферментные белки. При изучении протеинов (растительных белков) используют метод извлечения их

фракций

ГЛАВА 2____________________________________________________________

по растворимости (альбумины, глобулины, проламины и глютелины), предложенный американским исследователем Осборном.

Альбумины растворяются в воде, их можно выделить из ра- створа в виде сгустка денатурированного белка при кипячении. Из водных растворов альбумины осаждают также высаливани- ем при насыщении солями (сульфатом аммония и др.). Альбу- минный комплекс зерна в основном состоит из ферментов.

Глобулины растворяются в водных растворах различных солей (применяют обычно 5—10%-ный раствор NaCl). В чис- той воде они нерастворимы. Для выделения глобулинов из со- левого раствора применяют диализ с помощью полупроница- емых мембран или разбавляют большим количеством воды. Глобулины составляют большую часть семян бобовых культур.

Проламины — наиболее характерные белки для зерна большинства злаковых культур. Они растворяются в 60—80%- ном растворе этанола. К проламинам относят глиадин из зер- на пшеницы и ржи (составная часть клейковины), гордеин — ячменя, зеин — кукурузы, авенин — овса.

Глютелины растворяются в растворах щелочей (0,1—0,2%). Они мало изучены, так как их трудно выделить в чистом виде. Наиболее изучены глютелин зерна пшеницы (составная часть клейковины), оризенин риса и глютелин кукурузы. Разделе- ние протеинов по растворимости носит условный характер.

Современными методами установлена гетерогенность каж- дой из названных белковых фракций. Каждая из них состоит из нескольких, во многих случаях из многих десятков различ- ных белков, имеющих некоторые общие свойства.

Протеиды (сложные белки). Так называют вещества, состо- ящие из белка и соединения небелковой природы — просте- тической группы. По химической природе такие соединения подразделяют на липопротеиды, хромопротеиды, гликопро- теиды и нуклеопротеиды.

Липопротеиды, кроме белка, содержат липиды. Липо- протеиды в большом количестве входят в состав пластид рас- тительной клетки (хлоропласты), содержатся в протоплаз- ме, особенно в мембранах. Хромопротеиды — разнообразная группа, в которую входит гемоглобин крови. В гемоглобине

БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

белок глобин связан со сложным азотистым соединением, со- держащим железо. Это соединение является простетической группой и называется гемом. Гликопротеиды играют важную

роль в построении протоплазмы Они содержат различные углеводы.

Нуклеопротеиды имеют огромное значение в наследствен- ности. Высоко содержание нуклеопротеидов в зародыше зерна.

Внуклеопротеидах белок связан с нуклеиновыми кислотами. Азот входит в состав не только белковых веществ. В зерне

присутствуют и небелковые соединения, содержащие азот. Эти фракции называют небелковым азотом. В нормальном зерне пшеницы на долю небелкового азота приходится до 10% от общего его содержания. К небелковым азотсодержащим веще-

ствам относят главным образом свободные аминокислоты и амиды, подавляющая часть которых сосредоточена в алейро- новом слое и зародыше. Общее количество небелкового азота зависит от жизнедеятельности растения и зерна и может изме- няться в ту или другую сторону. Повышенное содержание не- белкового азота в основном можно рассматривать как резуль-

тат незавершенности биосинтеза белков в зерне или его порчи — распада белковых веществ при неблагоприятных ус- ловиях его хранения и переработки (прорастание и др.).

§ 9. ЗАПАСНЫЕ БЕЛКИ

Наибольшую часть белков зерна злаковых и бобовых (до N0%) составляют запасные белки, накопленные в ходе роста и развития зерна как питательные вещества, необходимые для развивающегося зародыша на начальных этапах прорастания.

Запасные белки (проламины и глютелины) локализова- ны в эндосперме. Считалось, что эти белки не обладают фер- ментативной активностью. Однако в последнее время пока- занo, что пшеничная клейковина, состоящая главным образом из проламина (глиадина) и глютелина (глютени- на) проявляет ферментативную активность. Альбумины и глобулины представлены в основном ферментами и струк- турными веществами. Они входят в состав мембран субкле- точных органелл зерна, образуют белки рибосом, митохон-

ГЛАВА 2_____________________________________________________________

дрий, эндоплазматического ретикулума— клеточной орга- неллы, представляющей собой систему мелких вакуолей, со- единенных между собой одинарной мембраной, в ряде слу- чаев переходящей в наружную ядерную мембрану.

В сложных белках — нуклеопротеидах, липопротеидах, фосфопротеидах и других белковую часть составляют альбу- мины и глобулины. У бобовых культур запасные белки пред- ставлены главным образом солерастворимой фракцией (гло- булинами), а у злаковых спирторастворимой (проламинами) и щелочнорастворимой (глютелинами).

Для белков важно содержание незаменимых (обязательных) аминокислот. Для человека их восемь: лизин, метионин, трип- тофан, валин, изолейцин, лейцин, треонин, фенилаланин. Эти аминокислоты, как и все другие, синтезируют микроорганиз- мы и зеленые растения, но не могут синтезироваться в орга- низме животного и человека. Незаменимые аминокислоты

должны быть обязательно введены в организм человека или животного с пищей. Если их будет в пище недостаточно, то нормальное развитие и жизнедеятельность организма наруша- ются.

Отдельные белки могут быть биологически неполноценны- ми по своему аминокислотному составу. Однако необходимо исследовать аминокислотный состав не отдельных белков, а всего их комплекса, содержащегося в пищевом продукте. Толь- ко при таком подходе могут быть получены правильные дан- ные об аминокислотном составе, а, следовательно, и о пище- вой и кормовой ценности продукта. Белки злаковых культур неполноценны по ряду незаменимых аминокислот, прежде всего по лизину, метионину, триптофану и треонину. Для пи- тания большое значение имеет сбалансированность аминокис- лотного состава белков.

По содержанию в белке незаменимых аминокислот, определяемых химическими методами, вычисляют аминокис- лотный скор, которым характеризуют биологическую цен- ность белка. В продукте (зерне) определяют содержание каж- дой незаменимой аминокислоты. Найденное количество

вычисляют в процентах к содержанию той же аминокислоты в идеальном белке (куриного яйца, молока). Чаще всего в ка-

70

БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

честве идеального белка применяют аминокислотную шкалу Комитета ФАО/ВОЗ* (табл. 6). Аминокислотный скор каждой незаменимой аминокислоты в идеальном белке (шкале ФАО/ ВОЗ) принимают за 100%.

Таблица б

Аминокислотная шкала для расчета аминокислотного скора по «проценту адекватности»

где АК — аминокислота.

По вычисленному скору определяют лимитирующую био- логическую ценность изучаемого белка—аминокислоту с наи- меньшим скором.

Более объективное представление о биологической (или пищевой) ценности белка или продукта в целом дают биоло- гические методы с использованием живых организмов. Наи- более распространенным во всем мире является рост-массо- вый метод, основанный на учете прибавки массы тела на единицу потребленного корма или белка за определенное вре- мя. Чаще всего используют крысят-отъемышей, у которых в

* ФАО — Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН — межправительственная организация, специализированное учреждение ООН. ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения

71

ГЛАВА 2

первые недели после отсаживания от матери скорость роста и увеличение массы тела зависят от накопления в теле белка. К рост-массовым показателям относят коэффициент эффек- тивности корма (КЭК) и коэффициент эффективности бел- ка (КЭБ). КЭК представляет собой отношение прибавки мас- сы животного (г) за определенное время к количеству потребленного за это же время корма. При использовании белка вместо корма расчет ведут с белком.

В таблице 7 представлено содержание незаменимых ами- нокислот в суммарных зерновых белках. Для всех альбуминов

характерно высокое содержание важнейших незаменимых аминокислот, в том числе лизина, треонина, метионина, изо- лейцина и триптофана, а из других аминокислот — глютами- новой и аспарагиновой. Наиболее высоким содержанием ли- зина выделяются суммарные альбумины овса, риса и проса, более низким — пшеницы, ячменя, сорго и ржи.

Таблица 7

Содержание незаменимых аминокислот в суммарных зерновых белках и потребность в них человека (%)

72

_________________________________________БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

В альбуминах ржи, сорго, риса много метионина; в альбу- минах овса, кукурузы, риса — изолейцина; в альбуминах пше- ницы, кукурузы, сорго, риса— триптофана. Треонин часто бывает дефицитной аминокислотой для злаковых культур, в альбуминах ячменя, ржи и овса его содержание высокое, в альбуминах пшеницы — самое низкое. Глобулины злаковых

также отличаются относительно высоким содержанием лизина. Вместе с тем у пшеницы, проса, сорго, риса и овса эта фракция белков лизином представлена беднее, чем альбуми- новая тех же видов.

Глобулины бобовых содержат высокий процент лизина (соя — до 6%). Вместе с тем глобулиновая фракция содержит

значительно меньше триптофана и метионина по сравнению с альбуминами. Однако для бобовых характерен высокий уровень аргинина (кукуруза 12,5%, просо 13,3%, рис 16,6%), аспараги- новой и глютаминовой кислот и очень низкий — пролина.

Альбуминовая и глобулиновая фракции представляют со- бой гетерогенные комплексы белков. Альбумины и глобули- ны играют существенную роль во всех проявлениях жизнедея- тельности зерна.

В пшеничной муке высшего сорта, почти полностью лишен- ной зародыша, алейронового и субалейронового слоев, число ут- раченных ферментов достигает нескольких сот. Среди них зна- чительное количество амилаз и протеаз. Альфа-амилаза в виде группы изозимов* составляет около 0,1%, бета-амилаза— около 0,5% общего белка. Очень малые количества протеолитических ферментов активизируются в процессах развития и жизнедея- тельности зерновки. Из других ферментов следует отметить фи- газы алейронового слоя, а также пептидные гидролазы.

Характерная особенность проламинов — низкое содержа- ние лизина, которого очень мало в проламинах пшеницы, сорго и ржи. Еще беднее этой аминокислотой зеин кукурузы и пани- цин проса: в них обнаружены лишь следы лизина. Низкое со- держание лизина в проламинах и высокий процент этой фрак-

* Изозимы (изоэнзимы, изоферменты) — ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию, но различающиеся по структуре и физико-химиче- ским свойствам.

73

ГЛАВА 2

ции в белках большинства злаков — основная причина их не- сбалансированности по лизину. Проламины также бедны тре- онином и триптофаном. Относительно богат триптофаном паницин проса. Триптофан практически отсутствует в зеине кукурузы и кафирине сорго.

Пеструю картину дает содержание в проламинах отдельных культур серосодержащих аминокислот (цистина, цистеина и метионина). В глиадине пшеницы найдено 1,9% цистина, в секалине ржи 2%, авенине овса 4,4%. В паницине проса и ори- зенине риса обнаружено немного цистина, а в кафирине сорго

— лишь его следы. Значительные расхождения по содержанию в проламинах злаков лейцина. В проламинах большинства зерен злаковых культур наблюдается высокий уровень лейци- на, прежде всего в зеине, кафирине и оризенине (17—18%). Мало лейцина содержат секалин, гордеин и паницин. Внешние факторы мало изменяют аминокислотный состав пролами- нов — при разных условиях азотного питания они имеют тот же аминокислотный состав.

Проламины, как и другие белковые фракции, представля- ют собой сложную смесь белковых компонентов. Для прола- минов характерна видовая и сортовая специфичность их ком- понентного состава. Эта особенность положена в основу

геномного анализа пшеницы для определения подлинности и сортовой чистоты семян по электрофоретическому спектру глиадинов. Разработана карта белков, при помощи которой различают, какими хромосомами контролируется синтез от- дельных глиадиновых компонентов у мягкой пшеницы.

Значительный удельный вес в общем белковом фонде зер- на злаковых приходится на фракцию глютелинов. Особен- ность глютелинов в том, что по аминокислотному составу они

занимают промежуточное положение между проламинами и глобулинами. Содержание лизина в них больше, чем в прола- минах: в глютенине пшеницы, ржи и ячменя составляет (со- ответственно) 1,7; 2,3 и 4%, в глютенине кукурузы, сорго, ржи, и проса— 2,4; 3,1; 4; овса— 5%. Глютелины отличаются от проламинов более высоким содержанием аргинина, гисти- дина, гликокола. По аминокислотному составу белок глюте- линов сбалансирован лучше, чем у проламинов.

БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

Более подробно изучены состав и свойства глютелинов пшеницы в виде изолированной фракции и в составе клейко- вины — глиадиново-глютенинового комплекса. Содержание лизина в глютенинах пшеницы, как и в глиадинах, невысокое.

На долю обеих фракций в пшеничной муке приходится более 80% белка и в целом зерне 50—60%. В связи с этим белки пше- ницы бедны лизином.

Полноценность зерна риса по аминокислотному составу находится на удовлетворительном уровне: у шлифованного риса 80% всего белка составляют глютелины оризенины, со- держащие 2,6—4% лизина. Преобладающие фракции овса — глобулины и глютелины, в которых содержится до 5,5% лизи- на, что приводит к хорошей сбалансированности овса по этой наиболее дефицитной аминокислоте.

§ 10. ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

Для выделения белков биологический материал измель- чают до разрушения клеточных стенок, получая гомогенат. Для этой цели применяют следующие способы: растирают ткани с твердым материалом — абразивом (кварцевый песок) и ступке; используют специальные вальцовые или шаровые мельницы, вращающиеся с большой скоростью острые ножи; продавливают в замороженном состоянии через фильеры спе- циального пресса; применяют ультразвуковые дезинте- граторы и др. При разрушении биологических тканей и вы-

делении белков всегда необходимо иметь в виду их большую неустойчивость, лабильность, склонность к утрате нативных свойств — денатурации. Затем пробу обезжиривают и при- ступают к извлечению белков. Наиболее часто белки извле- кают водой или солевыми растворами. Для извлечения бел- ков используют также спирто-водные смеси.

В состав биологических тканей входит множество белков. Большие трудности составляет разделение суммарной белко- вой смеси на индивидуальные белки — их фракционирование. Известно много методов фракционирования белков: органи- ческими растворителями, электрофоретические, хроматогра- фические, молекулярными ситами (сефадексами) и др.

ГЛАВА 2_____________________________________________________________

Фракционирование органическими растворителями. Для это-

го применяют этанол, ацетон, диоксан и другие в строгих ус- ловиях рН и температуры.

Электрофоретические методы. Основаны на движении заряженных молекул белков в электрическом поле. Скорость

перемещения молекул белка зависит от величины их зарядов при определенном рН и ионной силе раствора. Некоторое вли- яние оказывают форма и масса белковых молекул. Электрофо- рез проводят в растворе или на твердых влажных средах — в геле из крахмала, производных целлюлозы, полиакриламида (ПААГ), силикагеля, на хроматографической бумаге. Большая дробность фракционирования белковых смесей вплоть до вы- деления индивидуальных белков достигается при разновидно- сти электрофореза, называемого изоэлектрическим фокусиро- ванием. Здесь разделение белков происходит в поддерживающих средах с определенным градиентом рН, что обеспечивает поло- жение белка на определенном уровне в колонке. Градиент рН создают с помощью полиаминополикарбоновых кислот— ам- фолинов, дающих диапазон рН от 3 до 10.

Хроматографические методы. Основаны на разделении сме-

си веществ на основе их физико-химических различий между двумя фазами, одна из которых неподвижная, а другая — по- ток, фильтрующийся через неподвижную фазу. При жидко- стной хроматографии подвижной фазой бывает жидкость, при газовой — газ. Существует несколько видов хроматографии.

При адсорбционной хроматографии разделение смеси веществ происходит в результате различия их физической сорбции. При помощи распределительной хроматографии вещества из сме-

си распределяются между двумя разными не смешивающимися жидкостями.

Принцип ионно-обменной хроматографии — ионные вза- имодействия между растворенными веществами и носителем. В химии белков наиболее часто применяют ионообменную, молекулярно-ситовую (гель-проникающую) и аффинную хроматографию. При ионообменной хроматографии белки взаимодействуют с противоположно заряженными частица- ми ионообменных смол (ионитами) — твердых нераствори- мых веществ, заполняющих колонку, и вследствие этого раз-

76

________________________________________БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

деляются. Ионообменник имеет иониты, содержащие актив- ные группы основного характера и подвижные анионы (ани- ониты), и иониты, в состав которых входят активные кис-

лотные группы и способные к обмену подвижные катионы (катиониты).

Гель-проникающую хроматографию (гель-фильтрацию) называют еще молекулярным ситом. С помощью этого метода белки разделяют по размерам их молекул.

При аффинной хроматографии (хроматографии сродства) специально подобранные твердые носители избирательно свя- зывают строго определенные белки. Аффинная хроматогра- фия позволяет очень точно фракционировать белки.

Выделение молекулярными ситами. Для этого берут сефа-

декс — специальный пористый материал, получаемый обра- боткой эпихлоргидрином полисахарида декстрана.

В колонку, содержащую сефадекс (рис. 11), частицы кото-

рого окружены водной оболочкой и уравновешены буферным

Рис. 11. Механизм разделения веществ по молекулярной массе на колонке с сефадексом:

а — колонка в начале работы. Светлыми кружками обозначены зерна сефа- декса, темными точками — молекулы белков разной молекулярной массы, толь- ко что внесенных в верхнюю часть колонки; б- по мере продвижения прояви- теля по колонке (сверху вниз) осуществляется перенос молекул белков, однако только меньшие молекулы белков проникают внутрь зерен сефадекса; в — мелкие молекулы белков резко отстают от крупных его молекул, задерживаясь в зернах сефадекса. Первыми из колонки выйдут большие молекулы

77

ГЛАВА 2____________________________________________________________

раствором, вносят раствор смеси двух веществ разной молеку- лярной массы — белок и, например, соль. При фильтровании через гель сефадекса низкомолекулярное вещество (соль) мед- ленно диффундирует через поры набухших в воде частиц се- фадекса. Более высокомолекулярное вещество (белок) быст-

рее просачивается между частицами сефадекса и получается в свободном от низкомолекулярных примесей виде. При после-

дующем промывании колонки тем же буферным раствором медленно диффундирующее низкомолекулярное вещество (соль) удаляется. Таким образом регенерируют колонку. Вы- деленные белки часто содержат различные примеси. Для их удаления применяют очистку белков с помощью диализа, элек- тродиализа, ультрафильтрации.

Очистку диализом проводят следующим образом. Диали- зационный мешочек из полупроницаемого материала (целло- фана и др.), в который помещают исследуемое вещество, по- гружают на несколько суток в сосуд с проточной водой. Низкомолекулярные соединения и ионы отмываются, а круп- ные молекулы белка остаются в мешочке.

Наиболее быстрого и полного удаления ионов добиваются при помощи электродиализа (рис. 12). Кроме полупрони- цаемых мембран, ставят электроды, на них подают напряже- ние. В результате ионы переходят в омывающую мембрану воду и удаляются из аппарата. Для очистки белков методом

ультрафильтрации используют полупроницаемые мембраны высокой прочности с калиброванными порами, через кото- рые белковый раствор продавливают сжатым газом или цен- тробежной силой. При насыщении белкового раствора солью белки можно получить в кристаллическом виде. Ранее упо- минавшаяся гель-фильтрация с сефадексом также дает хоро-

шие результаты при очистке белков от низкомолекулярных примесей.

Каждый индивидуальный белок состоит из одного вида молекул, имеет определенную молекулярную массу, состав и строение. Это диктует необходимость оценки гомогенности, т. е. однородности выделенных и очищенных белков. Для это- го применяют большое число методов, общим признаком ко- торых является выявление физико-химических особенно-

78

________________________________________ БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

Рис. 12. Установки для очистки белка путем диализа (а) и электродиализа (б): 1 - трубка для подведения воды; 2 — корпус диализатора; 3— диализационный мешочек; 4 — трубка для отвода воды и регулирования ее уровня; 5 — капил- лярная трубка, А — диализационная камера; Б — корпус электродиализатора; а и а1, — полупроницаемые мембраны; б и б1, — электроды (стрелками указано направление движения воды)

с гей, характерных только для гомогенного белка. Очень важ-

ным способом определения однородности белков является их исследование в ультрацентрифуге. Принцип работы ульт- рацентрифуги заключается в том, что раствор, содержащий белковые молекулы, подвергается мощному воздействию центробежной силы, превышающей приблизительно в 500 раз силу земного притяжения. При этом сначала осаждаются более тяжелые молекулы, затем — менее тяжелые.

С помощью ультрацентрифуги можно разделить белки, раз- личающиеся по молекулярной массе. Аналитическая ультра- центрифуга снабжена оптическим устройством, регистриру-

ющим результаты анализа в виде кривой при прохождении света через специальные ячейки, содержащие раствор иссле-дуемого белка. Однородный по молекулярной

массе белок при испытании в ультрацентрифуге на кривой дает один симметричный пик. Если на диаграмме получается два пика или один несимметричный, то это значит, что белковый препарат пред-ставляет собой смесь, по меньшей мере, двух белков. Для определения однородности белков широко

используют также

ГЛАВА 2

разные виды хроматографии, в том числе и ранее рассмотрен- ные. Для определения однородности белка необходимо при- менять разные методы.

§11 . БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА ЗЕРНА ПШЕНИЦЫ

Содержание белка в пшенице колеблется в широких преде- лах — от 9,2 до 25,8% (в среднем 13,5%). При вегетационных опытах удается получать зерно пшеницы с еще большим со- держанием белка. Зерно твердой пшеницы содержит белков больше, чем зерно мягкой. В стекловидных зернах мягкой пше- ницы белковых веществ не всегда больше, чем в мучнистых. Так, коэффициент корреляции между стекловидностью и со- держанием белковых веществ зерна пшеницы из разных райо-

нов РФ за несколько лет составил

и из стран Американского континента

Показатель стекловидности лабилен, более поддается вли- янию разнообразных внешних факторов, чем содержание бел- ка. По отдельным тканям зерна пшеницы белковые вещества распределены неравномерно (табл. 8). Наиболее богат белко- выми веществами алейроновый слой. Много белка также в за- родыше. Содержание белка в эндосперме меньше, чем в целом зерне.

Впределах эндосперма белок распределен также неравно- мерно. Если его периферические слои имеют высокую кон- центрацию белков, то центральная часть наиболее бедна бел- ками по сравнению со всеми остальными частями зерна. Так, субалейроновый слой твердой краснозерной пшеницы содер- жит 45% белка, а внутренний 11% (рис. 13).

Впартиях зерна озимой пшеницы по мере уменьшения размеров зерна относительное содержание в нем белка воз- растает. Наибольшее количество белка содержит неполно- ценное зерно (проход через сито с круглыми отверстиями

0 2,38 мм).

________________________________________ БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

Таблица 8

Содержание белка (средние данные) в морфологических частях зерна пшеницы, % сухого вещества

Вряде работ отмечено отсутствие четкой зависимости меж- ду размерами зерна пшеницы и содержанием в нем белка. Сле- дует учитывать многообразные формы проявления физиоло- го-биохимической разнокачественности зерна. Необходимо различать мелкое, но нормально развитое и щуплое зерно. Мелкое, нормально развитое зерно по своему составу и каче- ству ближе к здоровому, крупному, чем щуплое зерно. Измене- ния содержания белка и других признаков зерна в зависимо-

сти от размеров зерна могут быть выражены в разной степени

ине имеют строгой закономерности вследствие большой био- логической изменчивости зерна при созревании на материн- ском растении под влиянием многочисленных факторов.

Впределах сорта фракционный состав белков изменяется в зависимости от крупности зерна: с уменьшением размеров се- мян увеличивается содержание водо- и солерастворимых бел- ков и снижается содержание спирторастворимых белков. В зер- не пшеницы Аврора при диаметре семян 3 мм водорастворимых

исолерастворимых белков содержалось 27,8% и при диаметре семян 2 мм — 32,9%, а содержание спирторастворимых бел- ков соответственно было 26,1 и 20,0%. Аналогичные данные получены и по другим сортам. В соотношении между фракци- онным составом белка и крупностью зерна пшеницы различ- ных сортов такой закономерности не наблюдается. Здесь мож-