Лекция 4 Репликация герпес вирусов

Размеры генома колеблются от 130 до 230 т.п.н. Мы рассмотрим подробно репликацию HSV-1 (152 т.п.н.) и EBV(172 т.п.н.).

По структуре ДНК герпес вирусы можно разделить на 6 групп.

А. На концах длинные повторы (вирус кошачьего сомика).

В. Концевые повторы состоят из повторов.

С.Концевые повторы из повторов и повторы во внутренней части генома.

(вирус обезъян Сайниры)

R4 R3 R2 R1

D.Правый сегмент фланкирован инвертированными повторами и может находится в двух ориентациях, левый сегмент всегда в одной ориентации (вирус псевдобешенства).

U_L Us

E.Несколько повторов на концах и внутри генома. Сегменты генома могут находится в двух ориентациях (вирус простого герпеса).

(а)_n b U_L b' (a)'_n c' Us c a

F.Особенные последовательности отсутствуют (вирус тупарий).

Инверсия сегментов не обязательна и возможен переход из одной группы в другую, например, вирус псевдобешенства, может перейти в группу D.

Типы циклов размножения:

-литический цикл (продуктивная инфекция): вирус простого герпеса (HSV)

-лизогенный цикл (латентная форма): EBV (существует в виде плазмиды)

Продуктивная инфекция вируса простого герпеса

При переходе из латентной в продуктивную форму, вирус вызывает появление лихорадки около губ и носа.

Ранее считали, что рання стадия репликации вируса проходит по схеме Кернса, поздняя – по схеме разматывающегося рулона.

При центрифугировании в градиенте CsCI в присутствии EtBr можно выделить ковалентно-замкнутые кольцевые формы ДНК.

В вирионе ДНК вируса имеет одноцепочечные разрывы, остатки РНК. Видимо, репарация вирусной ДНК осуществляется клеточными системами.

Свидетельство в пользу циркуляризации: появление новых сайтов для рестриктаз.

Механизм циркуляризации.

На концах выступает только по одному нуклеотиду, поэтому потенциал для циклизации есть. Возможно, участвует система рекомбинации клетки. (RCC1 ts мутанты (?)). Однако механизм в деталях неясен.

Репликация вируса осуществляется в ядре. Интересно! При изучении распределения вирусных репликативных белков в ядре с помощью флуоресцентной метки было установлено, что места репликации вирусной ДНК занимают фиксированное положение в ядре.

Инициация репликации.

Инициация внутренняя, без разрыва, посредством РНК затравки.

В геноме 3 ori: один ori_L в большом сегменте и 2 ori_S в малом сегменте внутри повторов с и с'.

Структура ori.

III I I III

o

АТ

ri_L

палиндром 20 нт палиндром

144 нт.

Этот участок трудно клонировать из-за наличия палиндромных последовательностей.

ori_S

III I II

АТ

палиндром 18 нт

90 нт (?).

Палиндромные последовательности служат участками узнавания для OBP.

Примечание: ori_S был клонирован в плазмиду и его способность к репликации изучалась в присутствии различных комбинаций вирусных и клеточных белков.

В репликации участвуют 7 вирусных белков.

Номенклатура белков HSV.

а) ICPхх (intracellular protein)

б) по положению в геноме: ULхх, USхх.

Мы будем пользоваться в основном второй номенклатурой.

UL9. OBP. Узнает и связывается с ori в виде димера. Взаимодействию способствуют/мешают клеточные транскрипционные факторы: ori фланкирован сайтами связывания SP1 и SP3 (возможно, в районе ori происходит транскрипция, но она не обязательна для репликации). Обладает АТФ-зависимой 3' – 5' хеликазной активностью. Вообщем, белок по своим активностям напоминает Т-Аg SV40.

Предложена вполне правдоподобная модель действия UL9.

UL9, как и Т-Аg SV40, связывается с ori_S в форме димера и фиксирует ДНК. После поворота колец друг относительно друга участок ori_S подплавляется и в ходе структурной перестройки образует крестобразную структуру - ori_S* (при действии UL9 в кольцевая ДНК суперскручивается и одним из способов снятия сверхспиральности – образование крестообразных структур).

UL9

ori_S*

III I II III I

АТ

III I

Принцип действия: фиксация участков ori ДНК в димере и их физическое изменение, приводящее к локальному плавлению ДНК.

Далее белок работает, как хеликаза и с появляющимися участками одноцепочечной ДНК связывается вирусный белок ICP8 (аналог SSB). Кроме этого, ICP8 взаимодействует с UL9 и стимулирует его хеликазную активность.

Обычно в репликации участвовала клеточная хеликаза с активностью 5'-3' (например, DnaB) в данном случае, к расплетенному участку присоединяется комплекс из трех вирусных белков: UL5 (хеликаза 5'-3'), UL52 (праймаза) и UL8 (вспомогательный белок, стабилизирующий РНК-затравку и активирующий некоторые клеточные белки).

Т.о. с помощью вирусных белков осуществляется расплетание ori, стабилизация расплетенного состояния и синтез затравки.

Отступление. В молекулярной биологии существует большая путанница в отношении того, что считать белком с четвертичной структурой, а что белковым комплексом, состоящим из самостоятельных белковых цепей. Выяснение этого вопроса ничего значимого не дает. Интересен тот случай, когда одна полипептидная цепь способна выполнять задачи, распределенные между отдельными белками. И важно понимание того, какие задачи решаются теми или иными белками, а не структура белковых комплексов.

Элонгация репликации.

В комплекс привлекается вирусная ДНК полимераза. Она состоит из двух субъединиц: UL30, обладающая каталитическим центром, 3'-5' экзонуклеазной и РНКазаН активностями, и UL42 – фактор процессивности. Ранее изученные нами факторы процессивности представляли собой олигомеры в виде колец способные к скольжению вдоль матрицы ДНК (β-субъединица РНК полимеразы III E.coli, фактор PCNA ДНК полимеразыδ эукариот). Однако вирусный белок UL42 работает в виде мономера, не имеет форму кольца и не способен к скольжению вдоль матрицы ДНК: он просто фиксирует полимеразу на участке ДНК. Но для синтеза ДНК необходимо смещение фермента относительно матрицы, как быть?

Предложено два объяснения механизма работы UL42.

1. UL42 фиксирует ДНК и полимеразу на ядерных структурах (например, цитоскелете) и способствует протаскиванию матрицы через фермент.

2. Во время работы у UL30 происходит смещение отдельных частей полипептидной цепи, эта подвижность передается на UL42 и вызывает акты диссоциации/ассоциации фактора.

Еще один участник процесса репликации клеточная топоизомераза. Фермент снимает сверхспиральность и тем самым не дает запутаться концам линейной ДНК вируса.

Соединение фрагментов Оказаки.

ДНК полимераза вируса удаляет РНК-затравки, клеточная лигаза зашивает разрыв.

Мы отметили, что в начале репликации имеется неопределенность с формой ДНК, но вскоре появляются ветвистые конкатемерные молекулы.

В ветвистом конкатемере ориентация большого сегмента постоянна, а малого меняется.

Ветвистость и инверсии легко объясняются, если предположить, что имеют место рекомбинация. Вирус герпеса имеет все основные компоненты системы рекомбинации аналогичные системе рекомбинации фага λ.

5'

3'

5'

Компонент с 5'-3' экзонуклеазной активностью создает агрессивный 3'-конец, который внедряется в дуплекс.

3'

В опыте, в клетках пораженных герпес вирусом ДНК SV40 становится конкатемерной и ветвистой.

Разрешение конкатемера.

Задачи решаемые упаковочной системой вируса:

1)узнать а-элементы генома

2)нарезать эквиваленты генома по а-элементы

3)игнорировать внутренние а-элементы

4)полностью заполнить головку (headfull-упаковка)

Описаны случаи, когда головка упаковывается короткими фрагментами, но их суммарная масса равна массе полного генома.

Структура а-элемента.

DR1(70 п.н.) – Ub(64 п.н.) – DR2(12 п.н.)_8-21 – DR4(37п.н.)_2-3– Uc(58-64п.н.) – DR1(70 п.н.)

DR – direct repeat. Мы видим, что это структура, состоящая из большого числа повторов.

В

GC – 3'

C – 5'

вирионе:

5' – AC

3' – GTG

Считается, что Uc является Рас1 участком, при ее узнавании разрыв вносится в правый DR1. Pac 2 участок находится в Ub и если узнается он, то разрыв вносится в левый DR1.

Уже было упомянуто выше, что левый конец может состоять из нескольких а-элементов (могут появиться в результате рекомбинации), какой из них будет узнан – не важно, важно, чтобы упаковался полный эквивалент генома.

Разрыв делает терминаза вируса, состоящая из двух субъединиц: UL28 (узнает Рас1) и UL15 (обладает АТФ-азной активностью).

Странно, что инверсия сохраняется в эволюции.

Белком не обязательным для репликации является тимидинкиназа. Фермент проявляет три активности:

а)тимидинкиназа (ТК)(Т – рТ);

б)тимидинмонофосфаткиназа (ТmP) (dT – ddT);

в)дезоксицитидиндикиназа.

В некоторых клетках он не нужен для репликации, но необходим для репликации вируса в нервных ганглиях (установлено по делеции этого гена).

Основой лекарственных средств, применяемых для лечения герпес-инфекции, является ацикловир. Это соединение фосфорилируется тимидинкиназой вируса. В фосфорилированной форме он является аналогом нуклеотида и блокирует синтез ДНК.