Тема 4. Введение в обмен веществ.

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН

Лабораторная работа № 5

Определение продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови

Принцип метода: Продукты перекисного окисления липидов (малоновый альдегид) образуют с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) окрашенный комплекс, экстрагируемый бутанолом.

Разность интенсивности окраски раствора при двух длинах волн прямо пропорциональна концентрации продуктов перекисного окисления липидов в нем.

Норма:2,12-4,8 мкмоль/л.

Оборудование и реагенты:

1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 535 нм и 570 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 20-37С;

2. Секундомер;

3. Водяная баня на 100С;

4. Центрифуга на 3000 об/мин (1800 g);

5. Автоматические пипетки с переменным объемом на 100-500 мкл и 1-3 мл;

6. Сыворотка крови;

7. Реагент (тиобарбитуровая кислота, 5 г/л);

8. Ортофосфорная кислота (раствор 1,4 %);

9. п-Бутанол;

10. Дистиллированная вода.

Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба
1. Ортофосфорная кислота	1 мл	1 мл
2. Сыворотка	100 мкл	--
3. Дистиллированная вода	--	100 мкл
4. Реагент	400 мкл	400 мкл
Пробирки накрыть колпачками и поместить в водяную баню на 45 мин при 100С. После кипячения пробирки охладить в холодной воде 3-5 минут.
5. п-Бутанол	1,5 мл	1,5 мл

Перемешать содержимое в пробирках, интенсивно встряхивая их до образования однородной белой суспензии розового оттенка. Затем пробирки центрифугировать 10 мин при 3000 об/мин. Сразу после центрифугирования отобрать по 1 мл супернатанта в чистые пробирки. Измерить оптическую плотность опытной пробы против холостой пробы при двух длинах волн 535 нм и 570 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска раствора стабильна в течение 1,5 часа после центрифугирования.

Расчет

Расчет содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке проводят по формуле:

А535 – А570 С (мкмоль/л) = -------------------------  15, 0,156

где А₅₃₅ и А₅₇₀– опт.плотность пробы при длине волны 535 нм и 570 нм,

соответственно;

0,156 – коэффициент молярной экстинции комплекса малонового

альдегида с тиобабитуровой кислотой;

15 – коэффициент разведения сыворотки.

Клинико-диагностическое значение:Образующиеся в процессе развития ПОЛ ненасыщенные альдегиды и малоновый альдегид являются мутагенами и обладают выраженной цитотоксичностью: подавляют активность гликолиза и окислительного фосфорилирования, ингибируют синтез белка и нуклеиновых кислот, окисляют белковые SH-группы, ингибируют различные цитозольные и мембраносвязанные ферменты.

Тема 5. Химия и обмен углеводов

Лабораторная работа № 6.

Определение концентрации глюкозы в крови ферментативным методом (с помощью прибора контроля уровня глюкозы в крови ONE TOUCH BASIC PLUS)

Принцип метода:Система контроля уровня глюкозы в кровиONE TOUCH BASIC PLUS предназначена для определения уровня глюкозы в цельной крови в домашних и клинических условиях. Система включает в себя приборONE TOUCH BASIC PLUS, тест-полоски, ланцеты и флакон с контрольным раствором.

Тест основан на глюкозооксидазной реакции, специфичной для глюкозы. На любые другие сахара тест не реагирует. После нанесения крови на тест-полоску компоненты последней реагируют с кровью в следующей последовательности:

Глюкозооксидаза Глюкоза + 2Н2О + О2 --------------------------> Глюконовая кислота+ Н2О2

Пероксид водорода реагирует с хромогеном (4-аминоантипирин) с образованием красителя хинонимина:

Пероксидаза Н2О2+ 4-Аминоантипирин + ГБС ------------------------> Хинонимин + 4Н2О

Интенсивность окраски пятна при длине волны 505 нм прямо пропорциональна концентрации глюкозы в нем.

Линейность метода:до 33,3 ммоль/л.

Норма:

Цельная кровь – 3,3-5,5ммоль/л (18-25С);

Сыворотка – 3,8-6,1 ммоль/л.

Оборудование и реагенты:

1. прибор ONE TOUCH BASIC PLUS;

2. тест-полоски;

3. ланцеты;

4. Стандарт (контрольный раствор 4,8-6,8 ммоль/л).