2.2.3. Исследование оттока лекарственного препарата in vitro
Полученные из П3ГБ и П(3ГБ-со-3ГВ) микрочастицы, нагруженные лекарственным препаратом, стерилизовали УФ-излучением в течение 20 мин и помещали в стерильные центрифужные пробирки с крышкой в 10 мл ФСБ (рН 7,3); пробирки экспонировали в термостате при 37 °С (n = 3). Пробы отбирались по истечении 3 часов; 6 часов; 1; 3; 7; 10; 14 суток. Для определения количества препарата, вышедшего в среду, анализировали пробы, предварительно осадив микрочастицы центрифугированием (10000 об/мин, 5 мин) на спектрофотометре Cary 60 UV-Vis (Agilent Technologies, США). Выход препарата DR в фосфатном буфере определяли по формуле:
,
где e – величина включения препарата в полимерной матрице, мг/мл;
r – выход препарата, мг/мл.
2.2.4. Культивирование клеток hela
Клетки HELA культивировали в DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10 %-го раствора эмбриональной бычьей сыворотки и 1 %-го раствора пенициллина/стрептомицина (100 ЕД). Клетки содержали в инкубаторе с 5 % CO2 при 37 °C до конфлюэнтности (Sanyo MCO-17AIC, Япония). Перед посевом, клетки были отделены с помощью обработки раствором трипсин-ЭДТА (3 мл; 0,05 % в СФБ) в течение 5 минут. Затем добавляли культуральную среду (3 мл), чтобы остановить активность трипсина. Суспензию клеток центрифугировали (3000 об/мин, 5 мин) и клеточный осадок ресуспендировали в среде (2 мл). Клетки подсчитывали с использованием гемоцитометра (BlauBrand, Германия).
2.2.5 Исследование цитотоксичности и эффективности действия полученных частиц в культуре клеток
Эффективность действия разработанных препаратов оценена в культуре опухолевых клеток HeLa. Для эксперимента были приготовлены полимерные микрочастицы из П3ГБ и П(3ГБ-со-3ГВ) с различной нагрузкой препаратами. При внесении микрочастиц в культуру клеток в виде суспензии концентрация инкапсулированного 5-фторуроцила составила: 0,43 и 0,34 мг/мл. Для этого клетки HeLa помещали в культуральные планшеты из расчета 1 × 10^4 клеток/мл в каждую лунку. Для контроля в культуру клеток была внесена свободная форма 5-фторуроцила в концентрации 0,43 и 0,34 мг/мл. В качестве среды использовали DMEM, содержащую 10 % раствор эмбриональной бычьей сыворотки и раствор антибиотиков (стрептомицин 100 мкг/мл, пенициллин 100 ЕД/мл). Суспензию стерильных частиц в 100 мкл фосфатного буфера вводили в каждую лунку 24-луночного планшета. Культивирование проводили в СО2-инкубаторе (New Brunswick Scientific, США) в 5 %-й атмосфере СО2 при 37 °С. Смену среды проводили ежедневно в течение 3 дней.
Жизнеспособность клеток в культуре HELA оценивали в реакции с МТТ, основанной на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать МТТ до формазана, что характеризует активность митохондрий и количество живых клеток и косвенно отражает способность клеток к пролиферации на матриксах. Для этого в лунку с каждым типом полимера было добавлено по 50 мкл 5 % раствора МТТ и 950 мкл полной питательной среды. Через 3,5 часа культивирования среду с раствором МТТ заменяли DMSO для растворения образовавшихся кристаллов МТТ-формазана. Через 30 мин супернатант был перенесен в 96-луночный планшет (Corning, США) и проведено измерение оптической плотности при длине волны 540 нм на микропланшетном фотометре Bio-Rad 680 (Bio-Rad Laboratories Inc., США). Количество клеток оценивали по калибровочному графику.
Также жизнеспособность клеток в культуре HeLa исследовали с помощью окрашивания клеток Live/Dead (Sigma-Aldrich, США).
Окрашивание клеток Live/Dead проводили согласно приложенному к красителю протоколу: рабочий раствор Live/Dead получали из 10 мл DPBS, 2 мкл кальцеина AM и 4 мкл EthD-1; для удаления белков сыворотки предварительно промывали культуры клеток раствором DPBS; наносили рабочий раствор из расчета 50 мкл раствора на 1 см 2 предметного стекла, инкубировали 45 минут при комнатной температуре; промывали культуру клеток раствором DPBS, производили подсчет клеток на матриксах при помощи флуоресцентного микроскопа Leica DM6000B (Германия).