Конъюгационный перенос.

Процесс контролируется опероном tra. В общем виде он представляет из себя:

1. образование конъюгационных пар.

2. установление специфичных клеточных контактов.

Перенос начинается с сайта oriT. Перенесенная ДНК может стойко поддерживаться в трансконъюгантах в автономном состоянии либо включаться в хромосомный репликон хозяина посредством рекомбинации.

Долгое время считалось, что конъюгация – исключительно свойство Enterobacteriaceae, однако в последние годы показана ее возможность и у других микроорганизмов. УEnterobacteriaceaeиPseudomonada-ceaeконъюгационный перенос обеспечивается тем, что плазмиды контролируют синтез секс-пилей для контактов. У грамположительных бактерий не обнаружены, у некоторых из них контакты между клетками обеспечиваются транспозонами (Streptococcus), фагами (staphylococcus) или экстрахромосомными ферромонами (Enterococcus).

При формировании клеточных контактов наряду с парами образуются агрегаты, в которых насчитывают до 13 скрещивающихся клеток. Эффективность спаривания не зависит от размеров агрегатов. Большинство скрещиваемых клеток способно формировать агрегаты в течение 30 минут, что, как предполагают, - результат роста и деления клеток, установивших контакты.

Способность спариваться клеток-доноров с клетками-реципиентами определяется наличием F-пилей у доноров. Тонкий механизм участия пилей в формировании клеточных контактов не выяснен до конца. Одно из объяснений его заключается в том, что последние – структуры, объединяющие конъюгирующие клетки и представляющие из себя трубки, через которые перемещается плазмида в реципиентную клетку. Другое предположение состоит в том, что, после столкновения двух соответствующих микроорганизмов и установления между ними начального контакта, пили действуют как в качестве крючков, взаимодействуя концом с поверхностью клетки реципиента. После дотрагивания пиля втягивается назад в донорскую клетку, чем обеспечивает контакт между клетками по типу «стенка к стенке». Затем формируется конъюгационная трубка.

Что бы быть компетентной в конъюгации, клетки-реципиенты должны обладать рядом свойств:

• Клеточная стенка должна иметь специфические рецепторы.

• Клеточная стенка должна пропускать одноцепочечную плазмидную ДНК.

Внешние факторы оказывают большое влияние на конъюгацию бактериальных клеток (состав питатель-ной среды, температура, время культивирования, изменение pHсреды: снижениеpHот 7.2 до 6.2 ведет к удвоению частоты спариваний).

Плазмидный перенос состоит из ряда стадий:

• Инициация ДНК плазмиды.

• Разделение цепей переносимой ДНК в клетке доноре. Для этого необходима насечка «надсечка» и раскручивание макромолекулы, что обеспечивается эндонуклеазами клетки – никазами.

• Перенос цепи. Он осуществляется в направлении от 5’ к 3’-концу, т.е. 3’-конец – ведущий. Перенос длится 15 – 20 минут.

• Конъюгативный синтез в клетке доноре

• Репликонация ДНК плазмиды в клетке-реципиете. Репликонация – конвертирование одноцепочечной ДНК плазмиды в двухцепочечную.

Репликонация осуществляется в виде 2-х процессов: синтеза комплиментарной цепи и кольцевания плазмиды. Изучение плазмид Fи сolпоказало необходимость для конъюгационного синтеза в клетках реципиентах ДНК-полимеразыIII(для синтеза цепи). ДНК-полимеразе для работы необходима затравка, которую обеспечивает либо РНК-полимераза, либо РНК-примаза.

ДНК плазмид прикрепляется ко внутренней мембране в реципиентных клетках, где она приобретает кольцевую форму после синтеза второй цепи.

Мобилизация – процесс, основу которого составляют метаболические реакции, обеспечивающие подготовку плазмиды к переносу. Мобилизация присуща как конъюгативным, так и неконъюгативным плазмидам. Конъюгативные плазмиды могут мобилизовать на перенос неконъюгативные плазмиды. Это применяется при скрещивание даже очень отдаленным видам. Еще в старых работах было показано, что мобилизация на перенос неконъюгативных плазмид резистентности конъюгативными плазмидами обычно дает трансконъюганты, в которых обе плазмиды сосуществуют физически неизменными, не ассоциированными. Однако в процессе мобилизации могут формироваться и стойкие коинтеграты. Например, исследования мобилизации конъгативных плазмид pRQ1 на перенос неконъюгативных плазмидpRQ2 в клеткахS.typhimurium, показало, что она сопровождается формированием коинтеграта плазмидpRQ6. Коинтегративный характер последних был подтвержден тем, что эта плазмида имеет резистентности обеих исходных, ее перенос термозависим, какpRQ1, и она несовместима с обеими исходными.

Существуют плазмиды, которые проявляют конъюгативные свойства лишь в присутствии реципиентных клеток, синтезирующих секс-ферромоны – низкомолекулярные полипептиды. Такие плазмиды установлены в клетках некоторых штаммов E.Faecalis. Они детерминируют лекарственную резистентность, гемолизины, бактериоцины и др. Ответ донорских клеток на ферромоны - через 20-30 минут. Он заключается в синтезе белковой фибриллярной иммунологически активной субстанции – адгезина – на поверхности клеток, что обеспечивает формирование агрегатов бактерий. Разным плазмидам соответствуют разные ферромоны.

Механизмами, ограничивающими перенос, являются поверхностное исключение, которое снижает вероятность переноса 100-300 раз и детерминируется плазмидными генами traStraTи неэффективность пилей. Кроме того, существуют ограничения, действующие после проникновения плазмид в клетки, так в результате изменения экспрессии плазмидных генов, клетки иногда не получают донорских свойств, плазмиды могут разрушаться рестриктазами, кодируемыми внутриклеточ-ным генетическим материалом (предполагают, что конъюгативные хромосомы с широким диапазоном переноса обладают генами с антирестрикционными функциями. Важными механизмом является летальный зигозис.