Вопрос №47 «строение развивающегося куриного эмбриона. Основные задачи, решаемые методом заражения кэ и его преимущества перед культивированием вирусов на лабораторных животных.

Используют КЭ в вирусологии в основном для тех же целей, что и ЛЖ: обнаружения в патматериале активного вируса биопробой; первичного выделения вируса; поддержания вирусов в лаборатории; титрования вирусов; накопления вируса для лабораторных исследований и получения вакцин; как тест-объект в реакции нейтрализации.

Строение: 1.Скорлупа 2.Подскорлупная оболочка 3.Воздушная камера 4.Аллантоисная полость 5.Желточный мешок 6.Альбуминный мешок 7.ХАО – хорион-аллантоисная оболочка 8.Амниотическая полость 9.Эмбрион 10.Канатик (соединение желточного мешка с пуповиной). С 5-12день КЭ могут использоваться для заражения

1) Скорлупа и подскорлупная оболочка служит хорошей защитой от факторов внешней среды. 2)КЭ содержат субстрат для выращивания вируса. 3)КЭ устойчивы к воздействиям связанных с выделением исследуемого материала. 4)КЭ легко доступны, экологичны, не требуют ухода, кормления, не образуют АТ.

6 методов заражения КЭ: 1)Заражение в аллантоисную полость (грипп, болезнь Ньюкасла). КЭ фиксируют вертикально тупым концом вверх, на стороне зародыша на 5-6мм выше границы воздушной камеры делают отверстие 1мм. Иглу вводят параллельно продольной оси на глубину 10-12 мм. 2)на ХАО (оспа, чума плотоядных): а)Ч/з естественную воздушную камеру. КЭ в штатив тупым концом вверх, в скорлупе против центра воздушной камеры окно 15-20мм. Снимают подскорлупную оболочку. На ХАО наносят 0,2 мм суспензии. Отверст. лейкопластырем. б)Ч/з искусственную воздушную камеру. Штатив горизонтально зародышем вверх. Делают 2 отверстия: над центром воздушной камеры, другое 0,2-0,5см сбоку, со стороны зародыша. Из первого зародыша отсасывают воздух, образуется искусственная воздушная камера, дном которого является ХАО, на него наносят инфекционную жидкость, заклеивают лейкопластырем. 3)В желточный мешок (хламидий, б. Марека): а)КЭ помещают в штатив вертикально. Отверстие над центром воздушной камеры, иглу на 3,5-4см под углом 45, противоположно месту нахождения зародыша. б)аналогичный путь заражения осуществляется на горизонтально укрепленном штативе КЭ; при этом зародыш находится внизу, а желток над ним. 4)В амниотическую полость (грипп, болезнь Ньюкасла): закрыт способ – зародыш. вверх. Иглу вводят затупленным концом по направлению к зародышу откр. способ – над воздушной полостью отверстие 1,5-2,5см. Удаляют подскорлупную оболочку. Пинцет продавливают ХАО по направлению к зародышу. Затем амниотическую оболочку вместе с ХАО и подтягивают к окну, водят туда суспензию. Отпускают. Лейкопластырь. 5)Заражение в тело зародыша. 6)в кровеносные сосуды.

Вопрос №48 «виды культур клеток и их использование в вирусологии. Краткая характеристика каждого вида».

Культура клеток (КК) – это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма. Методика культивирования особенно успешно стала развиваться после 40-х годов. Этому способствовали следующие события: открытие антибиотиков, предотвращающих бактериальное заражение КК, открытие Хангом и Эндерсом способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток. Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и получения однослойных КК. Применяют следующие КК: 1) ПТКК – клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой. КК можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Лучше это удается сделать из эмбриональных органов, т.к. клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для получения их используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 часов после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают, обрабатывают трипсином, панкреатином, коллагеназой. Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делится. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку, обычно через 3-5 дней. Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохранят жизнеспособность в течение 7-21 дня. При культивировании вирусов в КК удается получать препараты с высоким титром вируса, что важно при получении АГ и вакцин. 2) Субкультуры – их часто используют и получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, ресуспендирования в новой питательной среде и пересева на новые матрасы или пробирки. Через 2-3 суток формируется монослой. Они по чувствительности не уступают ПТКК, более экономичны. 3) Перевиваемые КК – клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лаборатория их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды). Получают их из первичных КК с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом , стабильны в условиях роста in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. «+» перед первичными – проще готовить, заранее можно проверить на наличие латентных вирусов и микрофлоры; клональные линии обеспечивают более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные. Большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные культуры. Но они склонны к злокачественному перерождению. 4)Диплоидные КК – морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся 3 фазами роста, сохраняющая в процессе пассирования кариотип свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации хомячкам. Их тоже получают из первичных клеток. В отличие от них имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50 -\+ 10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Преимущества перед перевиваемыми КК – 10-12 дней могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособны в течение 4 недель; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам. 5)Суспензионные КК – перевиваемые культуры клеток в суспензии.