Эпизоотологические особенности

Источники и пути передачи инфекции. Источник инфекции - больные животные. Инфекция передается воздушно-капельным путем. Считают, что естественная внутриутроб­ная инфекция поддерживает циркуляцию в стаде РСВ. Нет данных о наличии его в сперме б ыков- производителей,

Спектр патогенности. Среди КРС клинически болезнь бывает выражена у телят. Осо­бенно чувствителен к нему КРС герефордской породы. В 9 западных штатах США в 42% случаев с помощью РН обнаружены AT к РСВ у снежных баранов. Для проведения РН ис­пользовали шт. Mohanty A 51908, изолированный от КРС. РСВ удается заразить овец и бе­лохвостых оленей.

Диагностика

Диагноз на РСЕ ставят на основании эпизоотологнческих и клинических данных, пато-логоанатомических изменений и лабораторных исследований. Лабораторная диагностика РСИ заключается в следующем: обнаружении АГ в патологическом материале (мазках, от­печатках, срезах), полученном от больных животных в РИФ; выделение возбудителя из па­тологического материала в культуре клеток тестикул бычка (ТБ), почки эмбриона коровы (ПЭК) или легких эмбриона коровы (ЛЭК) и его идентификация в РИФ, РДП и РСК (8,11, 12, 42, 45).

Выделение вируса

Успех выделения вируса из патологического материала в большой степени зависит от правильности сбора и хранения подлежащих исследованию проб. Выделение РСВ затрудне­но ввиду его чрезвычайной лабильности. Выделить его от больных животных возможно только на ранней стадии инфекции и вероятность выделения снижается с появлением при­знаков заболевания. У телят вирус выделяли из носоглотки на 2-11-й день после заражения. Важно отметить, что РСВ, в основном, выявляют в выделениях и тканях дыхательных пу­тей. Лучшие результаты получают, проводя заражение культур клеток как можно скорее по­сле взятия материала и до исследования, избегая его замораживания. Однако выделение вполне возможно и из материала, хранившегося 3-5 ч при 4°С или быстрозамороженного и помещенного для хранения при -70°С.

Заражение культур клеток. Для выделения РСВ КРС используют прием сокультивирования клеток периферической крови или лимфоидных органов с чувствительными к реп­ликации РСВ клетками эмбриона КРС. Обычно выделение вируса проводят в первично-трипсинизированных культурах клеток эмбриона КРС (ПЭК, ЛЭК, ТБ). Культуры клеток овечьего происхождения (FLK, почки и семенники ягнят) обладают большей чувствительно­стью к РСВ КРС, и титр вируса достигает больших величин, чем в культурах клеток телят (до 10^! БОЕ/мл); в синцитиях наблюдали от 10 до 40 ядер. РСВ КРС хорошо размножается в клетках Vero, В связи с этим предложен метод селективного удаления вируса диареи, часто контаминирующего РСВ (4, 5, 18). Вирус можно выявить еще и до развития ЦПЭ при вы­ращивании клеток линии НЕР-2 на покровных стеклах при анализе их через 2-4 дня после заражения методом ИФ (14).

Идентификация вируса

Обнаружение специфических телец-включений. У экспериментально зараженных телят наблюдают резкие изменения в бронхах, бронхиолах и альвеолах, характеризующиеся появлением много ядерных эпителиальных клеток, многие из которых на 4-6-й день после заражения содержали эозинофильные тельца-включения. В зараженных культурах ПЭК, ЛЭК, ТБ, окрашенных по Селлерсу, Май-Грюнвальду, Гимза или гематоксилин-эозином, фокусы ЦПД состоят из синцитиапьных клеток различного размера. Такие клетки содержат гомогенные ацидофильные цитоплазматические включения различного размера и формы. Поскольку эти включения не окрашиваются акридиновым оранжевым, то они представля­ются оптически пустыми на фоне красной цитоплазмы.

ИФ. Идентификацию выделенного вируса проводят в ИФ, она чувствительна и точна. Постановка её аналогична таковой при диагностике аденовирусной инфекции, ИФ клеток респираторного тракта КРС выявляется в виде полиморфных флюоресцирующих включе­ний в цитоплазме или свечения всего цитоплазматического поля клетки. Для исследования в ИФ готовят мазки со слизистой оболочки носа, трахеи, а также препараты-отпечатки легких а лимфоузлов. Цитологический материал, используемый для ИФ, должен быть свежим, за­мораживание его резко снижает качество флюоресценции. Методом ИФ вирус обнаружи­вали в клетках бронхиального эпителия и альвеолярного экссудата в течение 11 лет. После заражения эпителиальные клетки легких, очевидно, являются клетками-мишенями для ви­руса, индуцирующего образование эпителиально-клеточного синцития во многих участках леток (22, 68, 71,72).

В ИФ можно использовать не только зараженные культуры клеток на покровных стек­лах, но и мазки, приготовленные из клеток зараженной пробирочной культуры. Мазки луч­ше всего готовить, когда, примерно, в 25% клеток монослоя наблюдается ЦПД.

РДП. РДП часто используют для идентификации вируса, выделенного в культуре кле­ток Методика постановки, приготовления АГ и учета результатов реакции аналогична тако­вой при диагностике аденовирусной инфекции.

PH. В ветеринарной диагностической практике РН применяется редко. Существуют штаммы, которые значительно хуже нейтрализуются иммунной сывороткой к прототипному штамму {например, шт. Long), чем гомологичной иммунной сывороткой. В подобном случае или при очень высоком титре исследуемого штамма синцитиальные клетки могут появиться и в пробирках с иммунной сывороткой. Однако в этом случае наблюдается значительно бо­лее позднее их появление по сравнению с контрольными пробирками (41,74).

ИФА. Предложен для определения AT PCB в парафиновых срезах легких телят, ес­тественно больных пневмонией. Специфическое окрашивание иммунопероксидазным конъ-югатом регистрируют в цитоплазме эпителиальных клеток, в синцитии малых бронхов, бронхиол и альвеол. Метод пригоден и для ретроспективной диагностики РСВ при исследо­вании парафиновых блоков, хранящихся в течение нескольких лет.

В качестве экспресс-диагностики предложен метод обнаружения РСВ путем точечной гибридизации с применением нерадиоактивного синтетического олигодезоксирибонуклео-тидного зонда (38). Такие зонды дифференцируют подгруппы РСВ в реакции гибридизации нуклеиновых кислот. Кроме того, предложен быстрый метод диагностики РСВ с помощью коммерческих тест-тампонов Pernasal. Последующий скрининг мазков в покровных стеклах с мечеными AT к РСВ показал, что данная процедура упрощает и ускоряет диагностику рес­пираторных вирусных инфекций (54). Обнаружение РСВ в секретах носоглотки можно про­водить одним из двух методов; либо методом гибридизации in situ с применением меченых биогином алигонуклеотидных зондов на геномную РСВ, либо меченым флюоресцеином. Иммунологический метод оказался более быстрым и эффективным (21). Возможно быстрое обнаружение РСВ в носоглоточных смывах с помощью обратной транскрипции и амплифи­кации в ПЦР ( 616 ).

Серологическая и ретроспективная диагностика. Основана на выявлении AT в сыворотке крови больных и переболевших животных в РДП, непрямой РИФ, РСК, РН и других реакциях. Для этой цели необходимо иметь высокоактивный эталонный РСВ. Испы­туемые сыворотки прогревают при 5б°С 30 мин. При РСБ, протекающей в естественных ус­ловиях, отмечали нарастание титра AT у животных в первые 10 дн болезни. ВНА были вы­явлены с 8-14-й дн у телят, свободных от материнских AT. Отмечена линейная корреляция между титрами AT, выявляемых в РСК и РН.

РН проводят в культуре клеток. Титр эталонного РСВ должен быть не ниже 10^! ТЦД50/мл . Для этого его пассируют до такого уровня, когда дегенерация 100% клеток на­ступает в течение 4 дн. При РН используют различные разведения сыворотки и постоянную дозу вируса 10³ ТЦД50/мл. Смесь сыворотки с вирусом выдерживают 2 ч при комнатной температуре, затем вносят по 0,2 мл в культуру клеток и инкубируют. Начиная с 4-го дня после заражения ежедневно проверяют пробирки с "контролем вируса". При признаках де­генерации у 75-100% клеток (обычно на 5-6-й дн) учитывают результаты всего опыта. Обычно в пробирках с сывороткой в интервале 3-5 последовательных разведений наблюда­ется отчетливое, но не полное подавление активности вируса, поэтому для оценки титра критерий полной нейтрализации вируса не используют.

Титром сыворотки считают разведение, подавляющее развитие синцития на основной площади клеточного слоя при возможном возникновении маленьких очагов синцития или округлении клеток не более чем на один плюс (25% клеток культуры, в которой обнаружи­вается дегенерация). Конечный результат, который учитывают в пробирках одного разведе­ния сыворотки, является средней величиной результатов, зарегистрированных в каждой из пробирок. При добавлении к культуре нейтрального красного в конечной концентрации 1:80000 синцитий в течение 1 ч при 36 °С окрашивается в красный цвет, что может помочь при оценке результатов. Повышению чувствительности РН способствует использование сы­вороток, не подвергавшихся нагреванию.

Более чувствительной и точной пробой для обнаружения и оценки уровня AT является реакция подавления бляшкообразовання. На клетках с покрытием из метилцеллюлозы син-цитиальные бляшки образуются в течение 4 дн. Бляшки легко обнаруживают и подсчиты­вают в культурах, окрашенных по Гимзе, под стереоскопическим микроскопом. Оценку ней­трализующей активности сыворотки можно провести по снижению титра бляшкобразования или разведению сыворотки, подавляющей образование 50% бляшек.

Метод непрямой ИФ применяют для выявления специфических IgM к РСВ, Предложен сухой эритроцитарный диагностикум РСБ. Положительные результаты в РИГА составляли 72,2%, в РН - 69 и в РСК - 55,2 %.

При сравнительной оценке эффективности различных методов было установлено, что титры AT в ИФА и РСК были сопоставимы. В РН в большем проценте AT выявлялись в острой фазе болезни и в меньшем- ELISA, что зависело от эффективности конъюгата при обнаружении ранних IgM. Однако РН была менее эффективна при постановке диагноза на основании увеличения титров AT в парных сыворотках, поскольку в полевых условиях не­которые животные могут быть исследованы относительно поздно и уловить нарастание тит­ров трудно. В качестве диагностического теста при РСБ КРС более эффективен ELISA как наиболее чувствительный, требующий меньших затрат труда, независящий от наличия чув­ствительной культуры клеток по сравнению с РН и РСК. Некоторые исследователи пришли к выводу, что наиболее чувствительной реакцией для серодиагностики острой РСБ является нарастание титра IgG при использовании ELISA (3). ELISA широко применяются в Швей­царии (30). РИГА используется для ретроспективной диагностики РСБ КРС. Этот простой высокоспецифичный метод более перспективен, чем РН.

Дифференциальная диагностика. По данным эпизоотологического анализа, клиниче­ским и патологоанатомическим признакам поставить диагноз очень трудно ввиду сходства РСБ со многими патологоанатомическими явлениями различной этиологии (ПГ-3, ВД-БС, ИРГ, хламидиоз и т. д.). Поэтому основу диагностики составляют лабораторные методы, а клинические показатели помогают ускорить постановку диагноза. Необходимо учитывать вероятность смешанной этиологии. Патологический материал, поступивший от животных с подозрением на РСБ, исследуют параллельно с помощью наборов диагностикумов, выпус­каемых биопромышленностью, на ИРГ, ПГ-3, ВД-БС и аденоинфекцию. Схема проведения исследований при РСБ аналогична аденоинфекции. Предварительный диагноз на РСБ ста­вят в патматериале в ИФ с учетом эпизоотологических и клинических данных, а также па-талогоанатомических изменений. Окончательный диагноз ставят на основании выделения и щдентификации вируса, совпадения результатов в РИФ с обнаружением AT в 30% и более вторых проб сывороток и обнаружения 4-кратного и более прироста AT в парных пробах сывороток (не менее 3-4 животных из 10-15 проб).