- •Индикация вируса в патологическом материале.
- •Изоляция (выделение) вируса из патологического материала.
- •Доказательство этиологической роли.
- •Куриный эмбрион развивается 21 день. Заражение вирусом производится с 5-го по 12-й день.
- •Заражение в аллантоисную полость.
- •Заражение через искусственную воздушную камеру на хао.
- •Рнга – реакция непрямой гемаглютинации.
- •Ртга – реакция торможения гамаглютинации
- •РтгАд – реакция торможения гемадсорбции
- •Естественная видовая резистентность.
- •Семейство Flaviviridae (flavus – желтый).
-
Рнга – реакция непрямой гемаглютинации.
Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов.
-
Ртга – реакция торможения гамаглютинации
-
РтгАд – реакция торможения гемадсорбции
-
РН – реакция нейтрализации.
Вирус + АТ. Контакт. Ввод в чувствительную к вирусу систему. Метод обнаружения – нейтрализация инфекционной активности вируса.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
ПЦР является наиболее чувствительным методом. Реакция обнаруживает вирусные НК. Реакция открыта в 1985 году в США.
Сутью метода является амплификация, т.е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекул ДНК in vitro. ПЦР основана на амплификации ДНК при помощи ДНК-полимеразы, которая осуществляет синтез взаимо-комплементарных цепей ДНК начиная с 2-х праймеров (затравок)
Primer – фрагмент ДНК из 20-30 нуклеотидов. Синтезированный искусственно. Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК. Обычно при ПЦР ставят от 25 до 40 циклов в зависимости от возбудителя. Каждый цикл состоит из трех этапов.
-
Денатурация. 92-95 градусов С, 20-60 секунд. Происходит разрыв водородных связей цепей ДНК.
-
Отжиг – присоединение праймеров. 50-60 градусов С, 40-60 секунд. Происходит забрасывание праймеров, нуклеотидов и ДНК-полимеразы.
-
Элонгация – достраивание цепей ДНК. 68-72 градуса С, 40-60 секунд. Число цепочек ДНК удваивается. Образовавшиеся в первом цикле цепочки ДНК служат матрицами для последующих циклов и т.д. Таким образом в каждом цикле идет удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать 225-240 участков ДНК, что позволяет обнаружить их методом электрофореза.
В ПЦР используют праймеры из консервативных участков ДНК вируса, которые имеют уникальную последовательность для каждого возбудителя.
Методика постановки.
Из исследуемого материала выделяют НК, которую помещают в чистую пробирку и добавляют амплифицирующую смесь, которая состоит из:
-
Буфера
-
ДНК-полимеразы
-
Раствора 2-х видов праимеров
-
4-х видов нуклеотидов
-
Магний-хлорного катализатора
-
Крезолового красного для визуальной оценки
-
Доливают деионизированной воды.
-
Сверху капают минеральное масло.
Пробирки помещают в програмируемый термостат-амплификатор и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе для соответствующего вида возбудителя (2-3 часа). Одновременно ставят положительный и отрицательный контроль.
Регистрация результатов – детекция амплификонов. Проводят методом электрофореза в 1-2% агаровом геле в присутствии бромистого этидия, который соединяется с фрагментами ДНК и высвечивается в виде полосок при УФО (трансилюминатор).
Противовирусный иммунитет.
В понятие противовирусного иммунитета входят три категории: видовая резистентность, неспецифические клеточные и обще физиологические реакции и специфический иммунитет.
-
Естественная видовая резистентность.
Естественная видовая резистентность это невосприимчивость большого количества видов животных к некоторым заболеваниям вирусной этиологии. Это обусловлено тем, что вирион не адсорбируется на поверхности клетки.
-
Абсолютная естественная видовая резистентность.
-
Относительная естественная видовая резистентность обусловлена тем, что невосприимчивое животное подвергнуто воздействию таких ослабляющих факторов как:
*стрессовые факторы
*большие дозы гормонов
*сильное охлаждение или перегрев
*возраст животного
*генетическая обусловленность.
-
Неспецифические клеточные и общефизиологические реакции.
-
Температура
-
Гормоны – снижают резистентность, однако соматотропные гормоны повышают резистентность и усиливают воспалительную реакцию.
-
Беременное животное заболевает быстрее и заболевание протекает более тяжело.
-
Физиологическое состояние выделительной системы – скорость выделения вируса из организма.
-
Гуморальные факторы – наличие сывороточных ингибиторов (термостабильных или термолабильных). У каждого вида преобладает свой тип.
Интерферрон – особый клеточный белок, который продуцируется зараженными клетками. Это несколько белков, отличающихся по молекулярной массе. По антигенной специфичности они делятся на альфа, бета и гамма белки. Они специфичны к вирусам, бактериям, синтетическим белкам.
Образование интерферрона состоит из двух фаз:
I фаза.
-
Индукция интерферрона при адсорбции вируса на клетке.
-
Захват индуктора.
-
Процесс инициации индуктора.
-
Депрессия генов интерферрона.
-
Транскрипция иРНК для интерферрона.
II фаза.
-
Трансляция иРНК-интерферрон.
-
Образование интерферроида.
-
Гликозирование интерферроида и образование интерферрона.
-
Выделение интерферрона.
Основная роль в образовании интерферрона принадлежит иммунокомпетентным клеткам.
1-й тип интерферрона – классический. Образуется в лимфоцитах периферической крови, молока, молозива в ответ на вирусную инфекцию.
2-й тип интерферрона - иммунный. Образован при помощи митогенов или при сенсибилизации клеток в ответ на повторное введение.
Взаимодействие интерферрона с клеткой.
-
Идет адсорбция на рецепторах клетки.
-
Индукция антивирусного состояния.
-
Развитие антивирусной резистентности.
-
Образование интерферрон-индуцируемых белков.
-
Выраженная резистентность клетки.
Механизм антивирусного действия интерферрона. – интерферрон не влияет на адсорбцию вируса, на виропексис, на процесс высвобождения НК вируса, не влияет на композицию вирусной частицы и ее выход. Интерферрон не действует на внеклеточный вирус в отличии от антител. Интерферрон подавляет репликацию вируса, т.е. он действует на вирус опосредованно, через чувствительную клетку в которой не нарушен синтез клеточной иРНК и клеточных белков.
Интерферроны делятся на экзо- и эндогенные. Эндогенные интерферроны образуются в пораженной клетке в ответ на введение вируса, т.е пока введенный вирус не успел достаточно разрушить клетку. Экзогенный интерферрон попадает в клетку из вне.
Свойства интерферрона.
-
Не обладает видоспецифичностью.
-
Экзогенный интерферрон проявляет свое максимальное действие, если заражение клетки ещё не произошло.
-
Стимулирует фагоцитоз
-
Угнетает рост клеток
-
Угнетает АТ-образование.
-
Способствует усилению активности Т-киллеров.
Специфический иммунитет.
-
Активный иммунитет.
-
Факторы гуморального иммунитета Ig G, ранний Ig M.
-
Секреторный иммунитет – защита естественных слизистых оболочек. Связан с Ig A – защита ЖКТ и дыхательных путей.
Специфическая профилактика вирусных инфекций.
-
Живые вакцины.
-
Полученные на основе адаптации полевых штаммов к какой либо чувствительной системе.
*к культуре клеток.
*к куриным эмбрионам
*к естественно восприимчивым лабораторным животным.
-
гетерологичные живые вакцины. (берут от индюков и заражают кур. Куры приобретают резистентность.)
-
метод селекции (за счет отбора естественных природных штаммов).
-
Инактивированные вакцины.
-
наработка вирус содержащего материала с использованием злых полевых штаммов.
-
Инактивация вируса (формалин, бета-пропиолактон, препараты азадинового ряда, температура, УФО, гамма-лучи, сульфат меди.
-
Добавление адьюванта в инактивтрованную вакцину. Адьювант адсорбирует на своей поверхности частицы разрушенного вируса. (сорбент-адьюванты: Al-Al(OH)3, SiO2 или масляные адьюванты).
-
Добавление сапонинов для суперраздражающего действия при в/м и п/к инъекциях. Применяют в очень малых концентрациях для образования воспаления в месте введения.
Семейство Picornaviridae. (pico-маленький, RNA)
Вирион лишен суперкапсида, кубической формы, 22-30 нм. Липидов и углеводов в составе нет. Геном - односпиральная, линейная РНК. Размножение происходит в цитоплазме клеток.
В семейство входят 5 родов:
-
Enterovirus - ЖК-заболевания, менингиты, энцефаломиелиты, коньюнкт-ты, везик пораж.
-
Hepatovirus – Гепатит А человека и обезьян.
-
Cardiovirus – поражение сердца, головного и спинного мозга.
-
Rhinovirus – поражение верхних дыхательных путей, распостраняется аэрогенно.
-
Aphtovirus – включает вирусы ящура.
Вирус Ящура.
Ящур – остропротекающая, высококонтагеозная болезнь парнокопытных, , проявляющаяся лихорадкой, везикулярным поражением слизистой оболочки рта, кожи венчика и вымени, у молодых животных – поражением миокарда и скелетных мышц. Регистрируется во всех странах мира.
Клиника.
У КРС и свиней протекает остро, как правило, доброкачественно. Инк. период – от 1-3 до 7-10 дней. Затем повышается темп, угнетение, отказ от корма, прекращение жвачки. На 2-3 день образуются афты, которые лопаются и обр эрозии.
У телят протекает в безафтовой форме в виде острого гастероэнтерита. 20-25% погибает от паралича сердца.
У свиней симптомы сходны с КРС, У поросят-сосунов протекает в септической форме (гибель 60-80%).
Вирус открыт Лефлером в 1898г. Вирус имеет одноцепочечною РНК (является инфекционной)
Различают 7 АГ вируса.
Источником вируса являются больные животные. Содержится в выдыхаемом воздухе. Чаще всего заражение происходит при непосредственном контакте животных.
Продолжительность иммунитета у переболевших животных – 8-12 месяцев. В настоящее время применяются сорбированные (КРС) и эмульгированные (для свиней) вакцины.
Семейство Poxviridae. (лат. pox –пустула, язва)
Поксвирусы – большая группа вирусов, поражающая позвоночных и насекомых. Вирион представляет собой овальную или прямоугольную частицу размером 220-450 на 140-260 нм. Частица имеет сложную структуру. Она состоит из центральной части – нуклеотида, овальных тел и наружной оболочки. Нуклеотид имеет двояковогнутую форму. Наружная оболочка состоит из липидов и трубчатых белковых структур.
Геном представлен двухспиральной молекулой ДНК. ДНК не обладает инфекционностью. С нуклеотидом связанно более 15 ферментов. Состав вириона по массе: белки – 88%, ДНК – 5%, липиды – 4%, углеводы – 3%.
Размножение идет в цитоплазме, затем вирус выходит из клетки, разрушая ее, а так же в результате экзоцитоза – без разрыва клеточной стенки. Вирус передается аэрогенно, механически и посредством членистоногих.
В семейство входят два подсемейства:
-
Entomopoxviridae (в практике не имеют большого значения, поражают насекомых).
-
Chordopoxviridae (поражают позвоночных и подразделяются на восемь родов):
-
Ortopoxvirus – вирус вакцины и вирус оспы КРС, верблюдов, енотов, обезьян, полевок и др.
-
Parapoxvirus - вирус ОРФ (контагиозного пустулезного дерматита и контагиозной эктимы ), вирус папулезного стоматита КРС, вирус псевдооспы коров.
-
Avipoxvirus – вирус оспы кур, индеек, перепелов, голубей, скворцов, канареек, воробьев)
-
Caprupoxvirus – вирус овец, коз, вирус кожной бугорчатки КРС.
-
Leporipoxvirus – вирус миксомы кроликов, вирус фибромы зайцев и белок.
-
Suipoxvirus – вирус оспы свиней.
-
Moluscipoxvirus – вирус контагиозного моллюска
-
Yatapoxvirus – вирус, вызывающий образование опухолей у человека и обезьян.
Оспа овец. (лат. Variola Ovina, англ. Sheep pox)
Оспа овец – острая контагиозная болезнь, протекающая с характерными папулезно-пустулезными поражениями кожи морды и других мест со слабым волосяным покровом и слизистых оболочек. Распространена преимущественно в странах Африки, Азии и Ближнего Востока. Занесена в список А. Приносит огромный ущерб: гибель животных, вынужденный убой, снижение продуктивности, затраты на вет-сан мероприятия.
Клиника. Первые симптомы – кратковременные повышения температуры на 1-2 градуса, вялость, снижение аппетита (предвестниковая стадия – 1-2 дня). Затем опухают веки, появляются истечения из глаз и носа. Затем появляются розеолы, превращающиеся в темно-красные, быстро некротизирующиеся папулы. Болезнь продолжается 20-28 дней, у слабых животных дольше. У взрослых животных при доброкачественной форме погибают 5-10%, у молодняка погибает 50-80% - в основном от сепсиса.
Этиологию установил Боррель в 1903г.
Вирус быстро погибает при высокой температуре и в гниющем материале. Долго сохраняется в сухих оспенных корочках. Попадает в организм с вдыхаемым воздухом, размножается в клетках эпителия дыхательных путей, и с током крови заносится в кожу. У суягных овец вызывает аборты. Источник инфекции больные животные. Восприимчивы только овцы (наиболее сильно – порода меринос)
Иммунитет и профилактика. Естественно переболевшие животные сохраняют иммунитет более 2-х лет.