Цитоплазма. Рибосомы. Клеточный центр

Таким образом, после фазы транслокации функционирующая PC при­ходит в состояние, аналогичное началу элонгации. Отличие состоит только в том, что с Р-центром взаимодействует не стартовая аа-тРНК, а пеп-тРНК. Эта ситуация определяет возможность вступления PC в очередной цикл элонгации, что и происходит.

ЭФ-1 присоединяет к свободному А-центру с третьим кодоном иРНК очередную, третью аа-тРНК с антикодоном, комплементарным третьему кодону. Появление в Т-центре аминокислотного остатка активирует пептидилтрансферазу, с помощью которой дипептид пеп-тРНК переносится на аминокислотный остаток третьей аа-тРНК. Таким образом, третья аа-тРНК становится пеп-тРНК, несущей трипептид, а пеп-тРНК с дипептидом осво­бождается от него.

Далее ЭФ-2 осуществляет транслокацию, в результате которой тРНК, находящаяся в Р-центре, выводится из PC, а пеп-тРНК с трипептидом пере­мещается из А-центра в освободившийся Р-центр и второй цикл элонгации завершается.

Циклическая работа PC на этапе элонгации продолжается до тех пор, пока в А-центре не оказывается какой-либо из трех терминирующих кодонов. В клетке не образуются тРНК с антикодонами, комплементарными терминирующим кодонам. Благодаря этому А-центр с терминирующим кодовом не может взаимодействовать ни с какой аа-тРНК и новый цикл элонгации не начинается - элонгация завершается в ситуации, когда Р-центр занят пеп-тРНК с полипептидом, который необходимо от нее освобо­дить. Такая трансляционная остановка служит сигналом начала этапа терминации трансляции.

Этап терминации трансляции осуществляется с помощью белкового фактора терминации (ТФ), или релизинг-фактора (РФ). ТФ способен взаимодействовать с терминирующими кодонами и поэтому связывается с А-центром, содержащим один из них. Второй особенностью ТФ является то, что после взаимодействия с А-центром он активирует пептидилтрансферазу Т-центра, которая катализирует отщепление полипептида от пеп-тРНК в Р-центре. Однако, ТФ не содержит свободного акцепторного аминокислотного остатка, к которому мог бы присоединится полипептид. В результате этого освободившийся С-конец полипептида взаимодействует с молеку­лой воды, а сам полипептид покидает PC.

На последней стадии терминации тРНК удаляется из Р-центра специальным белком, и происходит диссоциация иРНК, БС и МС. Этим завершается процесс трансляции, в ходе которого информация генов (ДНК) реализуется при посредстве иРНК на уровне полипептидов (белков).

В реальной ситуации для увеличения количества полипептидов, синтезируемых за еди­ницу времени, одна и та же молекула иРНК может транслироваться одновременно нескольки­ми PC. Такой комплекс иРНК с группой PC называют полисомой, или полирибосомой. При образовании полисомы происходит несколько последовательных этапов инициации трансля­ции разными PC В результате этого с иРНК одновременно взаимодействуют несколько PC, находящихся на разных стадиях (циклах) элонгации.

Процесс трансляции может нарушаться различными воздействия­ми, в том числе лекарственными препаратами, относящимися к груп­пе антибиотиков. Разные антибиотики подавляют различные этапы трансляции. Так, пактамицин и стрептомицин блокируют инициа­цию, тетрациклин и зритромицин - элонгацию, а пуромицин - терминацию. Так как прокариотические и эукариотические PC отличаются по своей структуре, существуют антибиотики, которые подавляют синтез белка в бактериальных клетках, не влияя существенным обра­зом на трансляцию в гиалоплазме эукариотических клеток.

Именно такие антибиотики используют при лечении многих ин­фекционных заболеваний бактериальной природы, например, стреп­томицин, тетрациклин и эритромицин. Однако, при интенсивной терапии такими антибиотиками необходимо иметь в виду, что они блокируют синтез белка не только в бактериальных клетках, но и митохондриях клеток больного. Это обусловлено тем, что митохондриальные PC имеют прокариотический план строения, подтверждающий эволюционное происхождение данного органоида из прокариотической клетки.

В ходе трансляции осуществляется формирование только первичной структуры полипептида, определяемой пептидными связями между опре­деленными аминокислотами. Однако, для нормального функционирования белков необходима их специфическая пространственная организация -конформация. Кроме того, многие белки имеют четвертичную структуру, т.е. состоят из двух или более полипептидов, взаимодействующих нековалентными связями.

Конформационное созревание белка должно происходить уже в ходе его синтеза в PC, так как при длине полипептида в 30-40 аминокислотных остатков его N-конец выходит из PC и оказывается в гиалоплазме. В резуль­тате этого появляется возможность взаимодействия между аминокислотны­ми радикалами с помошью различных связей (водородных, гидрофобных, дисульфидных). Таким образом, синтезирующийся белок способен приоб­ретать определенную конформацию еще в ходе трансляции (котрансляционно). Такой способ формирования активной трехмерной структуры характерен для многих мономерных белков, функционирующих в гиалоплазме.

Для ряда олигомерных белков гиалоплазмы и многих белков, транспор­тируемых из гиалоплазмы в мембранные органоиды или за пределы клетки (секреторные белки), спонтанное котрансляционное конформационное со­зревание является препятствием для их транспорта через мембранные транслокационные комплексы. Так как этот вид транспорта осуществляется практически на уровне первичной структуры полипептида, наличие у транс­портируемого белка сформированной трехмерной структуры требует ее разрушения, что сопряжено с большими энергетическими затратами.

Для предотвращения преждевременного конформационного созревания белков в клетке существует большое семейство белков, получивших название шапероны (от англ. chaperon - пожилая дама, сопровождающая юную леди при ее выходе в общество). Шапероны являются АТФ-зависимыми белками, способными нековалентно связываться с определенными гидро­фобными участками синтезируемого полипептида и тем самым предотвра­щать его конформационное созревание.

Такое взаимодействие является обратимым, т.е. шапероны при опреде­ленных условиях могут освобождать полипептид, после чего происходит формирование его естественной трехмерной структуры. Таким образом, шапероны - это функционально единая группа клеточных белков, которые способствуют нормальному конформационному созреванию других белков, но не входят в их состав и не участвуют в реализации их клеточных функ­ций. Белки этой группы являются универсальными для всех клеточных ор­ганизмов, присутствуя как в гиалоплазме, так и в мембранных органоидах, например, эндоплазматической сети и митохондриях. Наиболее изученное подсемейство шаперонов - это белки, имеющие молекулярную массу 70 кДа (Шап-70).

Шап-70 представляют собой полипептиды, содержащие около 700 аминокислотных ос­татков. В эукариотических клетках Шап-70 обнаруживаются в гиалоплазме, зндоплазматической сети, матриксе митохондрий и ядре. Белки этого подсемейства различаются по первичной структуре, но имеют сходную конформацию. представленную двумя глобулярными доменами.

N-концевой глобулярный домен Шап-70 содержит 450 аминокислотных остатков, очень сходных по своей последовательности у разных представителей этого подсемейства. По своей функции данный домен является АТФазой, т.е способен связывать и гидролизовать АТФ до АДФ и Фнеорг. При этом образовавшийся в результате гидролиза АДФ остается связанным с АТФазным доменом, но при определенных условиях может быть заменен на АТФ.

Второй, С-концевой, глобулярный домен Шап-70 включает около 200 аминокислотных остатков и характеризуется вариабельностью своей первичной структуры Функцией этого домена является нековалентное связывание пептидных участков белка на уровне их первичной структуры. Длина таких участков составляет не менее 13 аминокислотных остатков, поэтому их связывание эффективно предотвращает формирование трехмерной структуры соответст­вующего полипептида. При этом с одним полипептидом могут взаимодействовать несколько Шап-70.

АТФазный домен Шап-70 является регуляторным в отношении своего пептидсвязывающего домена. Связывание пептида осуществляется в том случае, если АТФазный домен нахо­дится в комплексе с АДФ. При замене АДФ на АТФ происходит изменение конформации АТФазного домена и, соответственно, пептидсвязывающего домена. Результатом этого явля­ется подавление функции пептидсвязывающего домена и освобождение полипептида от шаперона. После этого происходит гидролиз АТФ, изменения конформации обоих доменов, и шаперон вновь приобретает пептидсвязывающую активность. Ассоциация и диссоциация полипептида с Шап-70 в клетке регулируется специальными модуляторными белками, или кооперативными факторами. Один из них стимулирует замену АДФ на АТФ в АТФазном домене, и другой - гидролиз АТФ в этом домене.

Второе подсемейство шаперонов, Шап-90, представлено белками, имеющими молекулярную массу около 90 кДа (87-92 кДа). Как и Шап-70, они имеют два глобулярных домена - АТФ-связывающий и пептидсвязывающий, однако их АТФ-связывающий домен не обладает АТФазной ак­тивностью. В клетках животных обнаружено несколько Шап-90, способных взаимодействовать с различными белками гиалоплазмы (актином, тубулином, протеинкиназами, рецепторами стероидных гормонов). Связывание Шап-90 с синтезируемым полипептидом предотвращает его созревание и, соответственно, клеточную функцию.

Для освобождения полипептида от Шап-90 необходимы дополнительные сигналы. В частности, при синтезе рецепторов стероидных гормонов происходит их взаимодействие с димером Шап-90, в результате чего рецепторы не способны взаимодействовать с ДНК и регулировать работу генов. Это определяется тем, что Шап-90 связывает участок длиной в 80 аминокислотных остатков, который определяет структуру ДНК-связывающего домена рецеп­тора, и тем самым инактивирует этот домен. Взаимодействие рецептора, связанного с Шап-90, со стероидным гормоном изменяет конформацию рецептора и приводит к диссоциации рецеп­тора и Шап-90. В результате этого происходит формирование ДНК-связывающего домена и рецептор приобретает способность к регуляции действия генов

Кроме мономерных шаперонов, в клетках представлены и олигомерные шапероны, или шаперонины, состоящие из гомо- или гетеропротомеров молекулярной массой около 60 кДа. Благодаря этому шаперонины относят к подсемейству Шап-60. 12 протомеров Шап-60 взаимодействуют между собой и формируют структуру, называемую "пончиком", - два кольца, со­стоящих из 6 протомеров, объединенных в единый кольцевой комплекс.

Как и другие шапероны, Шап-60 имеют АТФ-связывающие домены (вероятно, в каждом протомере) и обладают пептидсвязывающей активностью Механизм действия Шап-60 изучен недостаточно, хотя есть основания считать, что связываемый полипептид приобретает зрелую конформацию после прохождения через центральное отверстие «пончика» Очевидно, Шап-60 взаимодействует с уже синтезированными белками, частично сформировавшими свою трех­мерную структуру.

По крайней мере для некоторых белков доказана необходимость связи с Шап-60 после их взаимодействия с Шап-70. В противном случае (участие только Шап-70) белок не приобретает необходимую зрелую конформацию. Такая ситуация характерна для белков, синтезируемых в гиалоплазме и транспортируемых в митохондрии.

В ходе своего синтеза они взаимодействуют с Шап-70 гиалоплазмы и переносятся к кон­тактным сайтам митохондрий. Здесь митохондриальные белки освобождаются от Шап-70 гиалоплазмы и транслоцируются в метрике мембранного органоида. В процессе переноса транспортируемый полипептид вновь связывается с Шап-70, которые находятся в матриксе митохондрий, т.е. с митохондриальными Шап-70. После завершения транспорта происходит освобождение полипептида от митохондриальных Шап-70 и его взаимодействие с Шап-60. Только после этого диссоциация полипептида и Шап-60 приводит к окончательному конфор­мационному созреванию митохондриального белка.

Кроме участия в формировании нормальной трехмерной структуры белков, шапероны необходимы и для обеспечения других процессов. Одним из них является деполимеризация клатрина - разрушение «клатриновой шубы», окружающей мембранные пузырьки, образующиеся в результате эндоцитоза. Так называемая "раздевающая АТФаза", осуществляющая деполимеризацию клатрина, является типичным шапероном подсемейства Шап-70.

При действии на клетки различных неблагоприятных факторов и веществ происходит денатурация активных белков, сопровождающая­ся изменением их конформации. В результате этого в белке образуются пептидные участки, с которыми способны связываться шапероны. Такое взаимодействие действительно происходит и может иметь 2 разных последствия.

Во-первых, связь с шапероном способна усилить степень денатура­ции и белок необратимо теряет свою активность, становясь ненужным клетке. В таких случаях шапероны транспортируют денатурирован­ные белки к лизосомам и направляют их в аутофагтческий цикл.

Во-вторых, взаимодействие с шапероном может приводить к такой реорганизации конформации поврежденного белка, после которой дис­социация шаперона ренатурацию белка, т.е. восстановление его исходной активной трехмерной структуры. Таким образом, в этом случае шапероны являются фактором, обеспечивающим определенную степень устойчивости белков (клеток) к неблагоприятным воздейст­виям.

Очевидно, данная функция шаперонов небезразлична для жизне­деятельности клеток, что представляется при различных стрессовых воздействиях. В этих ситуациях в клетках значительно повышается количество белков-шаперонов, которые необходимы для ренатурации поврежденных белков.

Первым таким стрессовым воздействием, выявившим повышение уровня определенных белков, оказался тепловой шок. Соответственно, эти белки получили название белков теплово­го шока, которые, как выяснилось позже, оказались типичными шаперонами. Тем не менее, термин «белки теплового шока» до сих пор используют как синоним термина «шапероны».