Экстремальные термофильные бактерии
Архебактерии Pyrococcus furiosus
(«яростные огненные шарики») обитают в сильнокислой среде «черных курильщиков», глубоководных вулканов,
P. furiosus развиваются при отсутствии молекулярного кислорода, потребляют CO2 при температурах 70-103°C.
Thermus aquaticus
Грамотрицательная палочковидная экстремально термофильная бактерия, облигатный аэроб, развивается при температуре выше 55 °С (оптимальной является температура 70 °C). Обитает в горячих источниках, гейзерах, два штамма были выделены из горячей водопроводной воды
Полимеразная цепная реакция
Объем реакционной смеси 25–50 мкл
1 цикл включает -денатурацию
-отжиг (ренатурация) реассоциация комплементарных цепей -синтез ДНК (удлинение праймера) в присутствии ДНК-полимеразы,
дезоксирибонуклеотидтрифосфатов и праймеров.
Термоциклер (амплификатор)
Taq-полимераза (70-75оС)
ПЦР
Схематическое изображение
первого цикла ПЦР.
1 - Денатурация при 94-96°C
(до 2 мин).
2 - Отжиг при 68 °C (до 2 мин). t отжига на 4—5°С ниже температуры плавления
праймеров.
3 - Элонгация при 72 °C для
Taq- и Pfu-полимераз.
4 - Закончен первый цикл.
|
Две получившиеся ДНК-цепи |
|
|
служат матрицей для следующего |
|
|
цикла, поэтому количество |
|
|
матричной ДНК в ходе каждого |
|
P = полимераза |
цикла удваивается. |
|
25-30 циклов |
||
|
•Результат электрофоретического разделения продуктов ПЦР- реакции. Агарозный гель окрашен бромистым этидием. Визуализация посредством облучения ультрафиолетом с длиной волны 312нм.
С.Н. Щелкунов. Генетическая инженерия. Сибирское университетское изд-во. Новосибирск. 2004. 496 с.
Генетическая инженерия
конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК),
или иначе - создание искусственных генетических программ
|
|
|
|
Генная инженерия |
||
Клеточная инженерия |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
(in vitro) |
|
|
(in vivo) |
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
Возможности генной
инженерии
1.Можно скрещивать индивидуальные гены видов, стоящих на разных ступенях эволюции. В основе рекомбинации гетерологичных ДНК in vitro лежит прием, позволяющий с помощью рестриктаз подготовить молекулы для скрещивания, то есть разрезать разные ДНК с образованием одинаковых липких концов.
2.Можно управлять процессом рекомбинации, так как он происходит в пробирке и не защищен запрещающими механизмами организма.
3.Можно предсказать результат, т.к. отбирается потомство одной молекулы ДНК (молекулярное клонирование).
ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Технология рекомбинантных ДНК (рДНК)
Этапы генетического конструирования in vitro:
1.Получение нужного гена (выделение нужных генов из ДНК, химико- ферментативный синтез, ферментативный синтез гена на основе выделенной мРНК);
2.Встраивание полученного гена в генетический элемент, способный к репликации (вектор), например, получение рекомбинантной плазмиды;
3.Введение гена в составе вектора (например, рекомбинантной плазмиды) в организм-реципиент, например в клетки E.coli;
4.Клонирование в E.coli фрагмента ДНК;
5.Идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели нужный ген или гены.
6.Полученные гибридные ДНК подвергают дальнейшим перестройкам и затем вводят в реципиентные клетки, изменяя их генотип и фенотип.
Векторы для экспрессии и клонирования
Требования, предъявляемые к векторам:
•Способность реплицироваться в клетке-хозяина (содержат ori репликации=Origin-точка начала репликации);
•Способность включать чужеродные ДНК различной молекулярной массы без нарушения способности к репликации;
•Легкость введения в клетку-хозяина;
•Наличие генетического маркера селекции, обеспечивающего быструю селекцию клеток, содержащих вектор;
•Наличие только 1 сайта рестрикции для каждой рестриктазы.
•Легко извлекаются из клеток хозяина
Плазмидные векторы
С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т.п.н.
