Две возможности конструирования сверхпродуцентов
Дикий штамм: |
|
|
Lys |
|
|
Увеличение |
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
Сверхпродуцент: |
|
|
Lys |
|
|
интенсивности |
|
|
|
|
биосинтеза |
||
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
Уменьшение |
Сверхпродуцент: |
|
|
Lys |
|
Х |
интенсивности |
|
|
|
катаболизма |
|||
|
|
|
||||
|
|
|
Дигидродипиколинат
синтетаза
7 стадий
аллостерический фермент аспартаткиназа, Lys и Tre
(совместно)
ингибиторы
Гомосериндегидрогеназа
Регуляция
биосинтеза лизина у
Brevibacterium flavum
Синтез лизина контролируется только на уровне
ретроингибирования одного фермента лизином и треонином. Этот контроль легко
Селекция на устойчивость к структурному аналогу целевого продукта
Основа метода: отбор клонов с нарушенной негативной регуляцией собственного биосинтеза
E1 |
E2 |
E3 |
A B |
Lys |
C |
Если в клетке в результате мутации ферменты, участвующие в биосинтезе, станут нечувствительны к негативной регуляции лизином, эта клетка может стать сверхпродуцентом
OH |
|
OH |
NH2 |
O |
NH2 |
O |
S |
|
NH2 |
|
NH2 |
S-(2-аминоэтил)цистеин (AEC) вызывает аллостерическое ингибирование бета-аспартаткиназы
Селективная среда
На среде с AEC вырастают только клетки, в которых нарушена негативная регуляция лизином, и поэтому они не чувствительны и к AEC.
Интактные клетки на этой среде не делятся, так как у них заблокирован биосинтез лизина
AEC
Использование селективной среды позволяет снизить количество исследуемых клонов до десятков
Ступенчатый отбор
При конструировании сверхпродуцента Trp использовали следующие его структурные аналоги
HO |
|
|
HO |
CH3 |
|
HO |
|
|
O |
|
CH3 |
O |
|
|
O |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
NH2 |
N |
|
NH2 |
N |
|
NH2 |
N |
F |
|
|
|
|
|
||||
|
H |
HO |
|
H HO |
|
|
H |
|
|
|
O |
|
O |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
NH2 |
NH2 |
|
NH2 |
|
F |
|
|
|
|
|
|
|
|
N |
Дикий штамм |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
селекции |
|||||||
Выход |
0.15 |
4.9 |
5.7 |
7.1 |
10.0 |
12.0 |
|
(г/л) |
|||||||
|
|
|
|
|
|
Отбор по биохимической недостаточности (ауксотрофности)
АУКСОТРОФНЫЕ (БИОХИМИЧЕСКИЕ) МУТАНТЫ - мутанты бактерий с дополнительными питательными потребностями из-за потери способности синтезировать те или иные вещества вследствие повреждения генов.
Сверхпродуценты L-Lys – ауксотрофы по L-Met, L-Tre, L- Ile
Отбор по биохимической недостаточности (ауксотрофности)
Селекция в два этапа:
1.После мутагенеза клетки высевают на полной среде
2.Клетки всех клонов высевают на среде без вещества Х Те клоны, которые не размножаются на этой среде -
ауксотрофы по Х, следовательно могут продуцировать Lys
вбольших количествах
Полная среда |
Полная среда |
Среда без Х |
Среда без Х |
Отбор по биохимической недостаточности (ауксотрофности)
Реверсия ауксотрофности:
1.Мутагенез
2.Отбор на селективной среде (без Х)
Выживают (размножаются) только те клетки, в которых в результате мутации вещество Х стало вновь синтезироваться
Селекция продуцентов пенициллина
•Висконсинская серия продуцентов
пенициллина, которая была осуществлена в США на штамме Penicillum chrysogenum с
применением различных физических и химических мутагенов. Селекция штаммов этой серии, продолжавшаяся более 30 лет, позволила повысить уровень продукции пенициллина в несколько тысяч раз по сравнению с уровнем исходного штамма.
Ограничения использования метода селекции:
• 1) нельзя скрещивать неродственные виды;
•2) нельзя извне управлять процессом рекомбинации в организме;
•3) нельзя предугадать, какое получится потомство.