3. Бактериологическое исследование
3.1. Сущность метода заключается в выявлении и выделении культур микобактерий и определении вида возбудителя туберкулеза.
Бактериологическое исследование биоматериала включает бактериоскопический, культуральный и биологический способы исследования.
Бактериоскопически и культурально исследуют биоматериал от каждого животного в отдельности. Для биологической пробы допускается составлять общую пробу не более чем от двух животных одного стада (фермы).
Исследование проводят в следующем порядке:
- микроскопия мазков-отпечатков, приготовленных из биоматериала или мазков, приготовленных из взвеси этого материала (при его посеве на питательные среды) и окрашенных по методу Циля-Нильсена;
- культуральное исследование (посев биоматериала на питательные среды);
- биологическое исследование (биопроба).
3.2. Бактериоскопическое исследование
3.2.1. Бактериоскопию проводят в целях определения наличия и степени обсемененности материала кислотоустойчивыми микобактериями. Сущность метода заключается в способности микобактерий, окрашенных фуксином, удерживать краситель после обесцвечивания их солянокислым спиртом.
Способ световой микроскопии обычно дает положительные результаты при содержании 100 000 и более бактериальных клеток в 1 мл материала. Результаты (положительные или отрицательные) микроскопии не дают основания для постановки диагноза на туберкулез у животных (кроме птиц) и обязательно должны быть подтверждены культуральным или биологическим методами исследований. При обнаружении микобактерий в мазках из материала от птиц, в органах которых отмечены патологические изменения, диагноз на туберкулез считают установленным и дальнейшие исследования не проводят. В случае отрицательных результатов микроскопии мазков проводят культуральное исследование материала.
3.2.2. Для микроскопии из каждого лимфатического узла и органа готовят по 2 мазка путем тщательного растирания материала между двумя стеклами (или прикладыванием свежим разрезом ткани к предметному стеклу) или же мазки готовят из высеваемой взвеси материала из каждой ступки (по 1 мазку) при посеве его на питательные среды. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем, окрашивают по Цилю-Нильсену (см. приложение № 1) и просматривают под микроскопом.
Для микобактерий туберкулеза характерны тонкие, прямые или изогнутые красные палочки различной длины, часто зернистые. Они располагаются небольшими скоплениями или одиночно.
Атипичные микобактерий морфологически трудноотличимы от возбудителя туберкулеза, однако чаще это грубые, толстые, как правило, незернистые палочки, различные по длине.
3.2.3. Для люминесцентной микроскопии мазки готовят из того же материала или взвеси и фиксируют, как указано выше, окрашивают смесью флуорохромов и просматривают под люминесцентным микроскопом при среднем увеличении. При наличии микобактерий в мазках они видны в виде светящихся, золотисто-оранжевого цвета палочек. Люминесцентный метод более чувствителен, но менее специфичен, поэтому его в большинстве случаев используют как сигнальный.
3.2.4. Иммунолюминесцентный метод дифференциации микобактерий (см. Приложение №2) позволяет идентифицировать и дифференцировать микобактерии из лимфатических узлов и внутренних органов, взятых от подозрительных на заболевание туберкулезом животных, культуры микобактерий и проб с объектов внешней среды.