Розділ 4. Характеристика сучасних методів визначення кокаїну

Для ідентифікації та кількісного визначення кокаїну та його метаболітів найпоширенішими є декілька методів: імуноаналіз, газова хроматографія (найчастіше з мас-спектрометричним детектуванням, іноді – детектор з електронним захватом), ВЕРХ та власне мас-спектроскопія.

4.1. Газова хроматографія (ГХ), особливо в поєднанні з мас-спектрометричним детектуванням, поряд із високоефективною рідинною хроматографією є найпоширенішими методами визначення кокаїну в різноманітних матрицях.

ГХ-МС характеризується високою чутливістю та специфічністю. Але тим не менше, цей метод вимагає дериватизації бензоїлекгоніну – перетворення полярних груп молекули на неполярні для зручності хроматографічного визначення, а також для отримання відносно інтенсивного сигналу молекулярного іону [5].

У роботі [3] повідомляється про можливість одночасного визначення кокаїну та всіх його метаболітів, що були наведені на рис. 1 – бензоїлекгоніну, норбензилекгоніну, метилового естеру екгоніну, екгоніну, норкокаїну, метилового естеру ангідроекгоніну (унікальний побічний продукт, що утворюється при курінні креку), продуктів взаємодії кокаїну із етанолом, ангідроекгоніну, норкакаетилену і етилового естеру екгоніну. Пробопідготовка полягала у використанні автоматизованої установки для твердо фазної екстракції Zymark^® RapidTrace^TM. Перед введенням до колонки проба підлягала дериватизації сумішшю 2,2,3,3,3-пентафлуоро-1-пропанолу (PFP) та пентафлуоропропіонового ангідриду (PFPA). Дія PFPA полягала у блокуванні гідроксильної групи та вторинного аміну, що дозволило отримати стабільніші сигнали від сполук із цими групами. PFP дериватизував карбоксильні групи.

Аналіз здійснювали за допомогою газового хроматографа Hewlett Packard (HP) 6890 series GC з детектором HP 5973 quadrupole MS; капілярна колонка HP-ULTRA-1 crosslinked 100% methyl siloxane (12 м х 0,2мм х 0,33 мкм); газ-носій – гелій (швидкість потоку постійна, 1 мл/хв.). Екстракт об'ємом 1 мкл вводили за допомогою автосамплеру HP 6890 в колонку. Хроматографування проводили в режимі без ділення потоку, температура порту 250 ⁰С. Хоча за температурною програмою досягається вища температура, ніж заявлена для інжектора, вищою її не можна робити, оскільки кокаїн миттєво потне розкладатися до свого основного продукту піролізу - метилового естеур ангідроекгоніну. Температурна програма включала в себе декілька етапів: 70 – 130 ⁰С при 30 ⁰С/хв.; 130 – 140 ⁰С при 5 ⁰С/хв.; 140 – 210 ⁰С при 35 ⁰С/хв.; 210 – 222 ⁰С при 4 ⁰С/хв.; 222 – 290 ⁰С при 45 ⁰С/хв. та 0,49 хв для встановлення рівноваги термостат-колонка. Загальний час розгонки становив 11 хв. Для встановлення відповідності піків та кількісного аналізу досліджували стандартні зразки кокаїну та кожного з його метаболітів (1 мкл 100 нг/мл). Сканування проводили в діапазоні від 50 до 600 атомних одиниць маси. Детектування проводили за сигналами найбільш стійких іонів (молекулярних чи осколочних, табл. 1).

Таблиця 1.

Часи утримування та характеристичні іони досліджуваних сполук [3].

Сполука	Дериватизована форма	Характеристичні іони, m/z	Час виходу
AE	PFP	270, 299, 271	3,00
AEME	-	152, 181, 166	3,34
E	PFP/PFPA	300, 463, 314	3,71
d-EME	-	185, 348, 317	4,02
EME	PFPA	182, 345, 314	4,03
EEE	PFPA	196, 359, 314	4,53
d-BE	-	303, 424, 319	7,22
BE	PFP	300, 421, 316	7,23
NBE	PFP/PFPA	312, 431, 214	7,52
HBE	PFP/PFPA	300, 583, 434	7,80
d-COC	-	185, 306, 275	7,85
COC	-	182, 303, 272	7,86
d-CE	-	199, 320, 275	8,27
CE	-	196, 317, 272	8,28
NCOC	PFPA	313, 435, 214	8,33
NCE	PFPA	327, 214, 105	8,72

Типова хроматограма, отримана за цією методикою, наведена на рис. 4. Як видно із наведеної хроматограми, всі піки повністю розділені, окрім кокаетилену і норкокаїну . Але характеристичні йони даних сполук значно розрізняються за m/z, тому при ідентифікації і кількісному визначенні неповне розділення даних піків не є проблемою. Як внутрішні стандарти використовували дейтеровані кокаїн, бензилекгоніл, кокаетилен і метиловий естер екгоніну. Для аналітів, що не мали дейтерованого аналогу як внутрішнього стандарту, визначення проводили за допомогою найближчого за структурою наявного стандарту.

Рис. 4. Хроматограма досліджуваної суміші кокаїну та його метаболітів за концентрації кожного 800 нг/мл. Ідентифікація піків: 1 – ангідроекгонін; 2 - метиловий естер ангідроекгоніну; 3 – екгонін; 4 - метиловий естер екгоніну; 5 - етиловий естер екогніну; 6 – бензоїлекгонін; 7 – норбензолекгонін; 8 - м-гідроксибензоїлекгонін; 9 – кокаїн; 10 – кокаетилен; 11 – норкокаїн; 12 – норкокаетилен.

Кількісні характеристики методу наведені в таблиці 2. Метод є досить простим, надійним і точним для одночасного визначення кокаїну та 11 його метаболітів зразках біологічних рідин та тканин.

Таблиця 2.

Межа виявлення, межа кількісного визначення, лінійний динамічний діапазон для кокаїну та його метаболітів; аліквота досліджуваного зразку – 3 мл крові; концентрації, менші за 0,78 нг/мл, не досліджувались [3].

Сполука	МВ, нг/мл	МКВ, нг/мл	ЛДД, нг/мл	r2
Кокаїн	0,78	0,78	0,78-3200	0,999
Норкокаїн	0,78	1,56	1,56-1600	0,999
Бензоїлекгонін	0,78	0,78	0,78-3200	0,999
Норбензилекгонін	3,12	3,12	3,12-800	0,999
м-Гідроксибензоїлекгонін	1,56	1,56	1,56-3200	0,993
Метиловий естер екгоніну	1,56	1,56	1,56-3200	0,998
Екгонін	12,5	25	25-1600	0,999
Кокаетилен	0,78	0,78	0,78-3200	0,999
Норкокаетилен	0,78	1,56	1,56-1600	0,998
Етиловий естер екгоніну	0,78	0,78	0,78-3200	0,997
Метиловий естер ангідроекгоніну	0,78	0,78	0,78-3200	0,998
Ангідроекгонін	12,5	12,5	12,5-3200	0,999

Автори [8] повідомляють про розробку методики ГХ-МС визначення кокаїну та деяких інших наркотиків у волоссі шляхом ферментативного гідролізу за допомогою пронази Е. Хроматографування проводили в режимі без ділення потоку, вводячи 2 мкл проби в інжектор. Температура порту становила 240 ⁰С. Капілярна колонка – НР-5 (30 м х 0,22 мм х 0,33 мкм, 5 % метилфенілсилоксан). Температурна програма колонки: 90 ⁰С протягом 1 хв, 90 – 190 ⁰С при швидкості 30 ⁰С/хв., при 190 ⁰С протягом 1 хв, 190 – 260 ⁰С при швидкості 8 ⁰С/хв. і витримували при температурі 260 ⁰С протягом 5 хв. Потім температуру колонки збільшували до 290 ⁰С і очищували колонку. Швидкість потоку газу-носія (гелію) 1 мл/хв. Сполуки ідентифікували за часами утримування і трьома характеристичними іонами. Як внутрішні стандарти використовували дейтеровані аналоги досліджуваних речовин.

Кількісні характеристики визначення кокаїну даним методом: МВ 0,04 мг/г і МКВ 0,13 мг/г.

У роботі [9] описаний дуже точний і чутливий метод визначення кокаїну та двох його важливих метаболітів (бензоїлекгогіну та продукту взаємодії з етанолом – кокаетилену) у людському волоссі на основі дериватизації бензоїлекгоніну алкілхлорофоміатами (у присутності ацетонітрилу і піридину) і екстракції сполук твердофазною мікроекстракцією. Типова хроматограма наведена на рис. 5.

Для ідентифікації і кількісного визначення використовували ГХ-МС в режимі селективного моніторингу іонів. Умови хроматографування: колонка НР5МS (30 м х 0,25 мм х 0,25 мкм), температура порту 250 ⁰С, температурна програма – 150 ⁰С протягом 1 хв, при швидкості 10 ⁰С/хв. до 250 ⁰С і при цій температурі витримували ще 9 хв. МВ і МКВ для кокаїну і кокаетилену становили 0,1 нг/мг і 0,5 нг/мг для бензоїлекгоніну. Динамічний лінійний діапазон становив 0,1 – 50 нг/мг для кокаїну. Метод є швидким і легким для виконання.

Рис. 5. А – хроматограма, отримана із зразку вільного від наркотиків волосся, на яке наносили 47,4 нг/мг кокаїну (1), 1,3 нг/мг кокаетилену (2) і 4,1 нг/мг бензоїлекгоніну (3); В – хроматограма екстракту волосся без наркотиків; С – хроматограма волосяя мертвого наркоману, в яке внесли по 1 нг/мл кожної речовини.

Ціллю роботи [10] була розробка двохступінчастої стратегії аналізу вмісту кокаїну та опіатів у людському волоссі за участю імунологічного скринінгу і підтвердження отриманих напівкількісних результатів за допомогою ГХ-МС. Був розроблений та підтверджений автоматизований напівкількісний імуноферментний метод аналізу для аналізу слини (ELISA тест). Такі скринінгові методи є швидкими і дешевими для автоматизованого підтвердження наявності кокаїну в волосі чи інших об’єктах. Наприклад, вони є чудовим доповненням для традиційної у судово-медичній експертизі процедури ГХ-МС.

Пробопідготовку проводили за допомогою твердофазної екстракції. ELISA тест відбувався на мікротитрувальних пластинах із нанесеними антитілами із високою спорідненістю до досліджуваних препаратів. Зразок слини поміщали у мікротитрувальну пластину, а потім і ферментний кон’югат. В цей час фермент коньюгує із досліджуваними сполуками в зразку. Потім розчин промивали від всіх будь-яких незв’язаних сполук. Додавали субстрат для повноцінного розвитку забарвлення. Інтенсивність цього забарвлення була обернено пропорційна вмісту досліджуваних сполук у зразку.

Дериватизацію здійснювали за допомогою N-метил-N-триметилсилілтрифлуороацетаміду. Для інжекції використовували 1 мкл екстракту. Колонка - НР5МS (30 м х 0,25 мм х 0,25 мкм). Температурна програма: 180 ⁰С протягом 1 хв, до 190 ⁰С зі швидкістю 10 ⁰С/хв. і підтримували протягом 10 хв, далі зі швидкістю 5 ⁰С/хв. підняли температуру до 250 ⁰С і зі швидкістю 30 ⁰С/хв. досягли 290 ⁰С (2 хв). Загальний час розгонки 21,28 хв. Температура порту, іонної пушки, квадруполю і інтерфейсу становили відповідно 280, 230, 150 і 290 ⁰С. Хроматографування проводили у режимі без ділення потоку; як газ-носій використовували гелій зі швидкістю потоку 1,0 мл/хв.

Мас-спектри отримували за допомогою іонізації електронним ударом і фіксували у режимі повного сканування. Наприклад, кокаїн ідентифікували за піками з m/z 182, 303, 272. Типова хроматограма наведена на рис. 6.

Рис. 6. Хроматограма зразку волосся, що містив 5,84 нг/г кокаїну (СОС), 1,68 нг/мг бензоїлекгоніну (ВЕ).

Найчастіше для визначення кокаїну на поверхні банкнот використовується ГХ-МС [11]. Також є інші аналітичні підходи, робота яких базується на використанні ГХ, і їх можна розділити на 3 групи залежно від способу детектування:

• Азотно-фосфорний детектор (GC-NPD)

• Мас-спектрометрія (GC-MS)

• Тандемна мас-спектрометрія (GC-MS²)

Найчастіше використовується іонізація електронним ударом, але є публікації і з застосуванням хімічної іонізації. Останнім часом для визначення кокаїну в євро-банкнотах використовують GC-MS² для підвищення чутливості визначення. Межа кількісного визначення при цьому становить 0,15 нг кокаїну на банкноту, а відносне стандартне відхилення при використанні 1 нг/мл розчинів у 20,5 мл метанолу на банкноту становило до 6 %. Можна стверджувати, що на основі використання GC-MS² розроблені чутливі та селективні методики визначення залишкових кількостей кокаїну на банкнотах. Основним недоліком цього методу, як і GC-MS, є тривала і обов’язкова пробопідготовка, що значно збільшує тривалість та вартість аналізу. Таких недоліків немає при використанні прямої термодесорбції із тандем ним мас-спектрометричним визначенням чи імуноаналізу.

4.2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ).

В останні десятиліття ВЕРХ стає класичним методом успішного та ефективного визначення кокаїну та його метаболітів (в першу чергу бензоїлекгоніну) у найпоширеніших об’єктах – біологічних рідинах [5]. Взагалі ВЕРХ є найбільш привабливим і універсальним методом для визначення наркотиків в біологічних рідинах, оскільки він забезпечує можливість регулювання селективності і роздільної здатності в широкому діапазоні. Крім того, завдяки м'яким умовам хроматографування (порівняно з ГХ), ВЕРХ є найкоректнішим методом для аналізу термічно лабільних сполук. Крім того, ВЕРХ не потребує додаткової стадії дериватизації полярних продуктів метаболізму кокаїну (в тому числі і бензоїлекгоніну, якого фіксують в найбільших кількостях у біологічних рідинах).

Автори [12] розробили метод одночасного визначення кокаїну і бензоїлекгоніну у плазмі крові людини за допомогою ВЕРХ-МС/МС. Але працівникам лабораторій, які не обладнані сучасними хроматографами РХ-МС/МС, доведеться проводити складнішу пробопідготовку, яка додатково включає складну стадію відділення наркотиків від основної маси плазми крові. Та із використанням РХ-МС/МС цей етап можна значно спростити. Декілька сумішей розчинників та комерційно доступних SPE-картриджів були протестовані при різних значенях рН. Найкращі результати були отримані при використанні картриджу Oasis HLB (вилучення 71% кокаїну і 92,4% бензоїлекгоніну), таблиця 3.

Таблиця 3.

Вилучення кокаїну та бензоїлекгоніну із плазми крові людини сумішами розчинників та SPE-картриджами (метанол:аміак, 19:1 v/v)

Суміш роз-ків	рН	С, нг/мл	Rкок, %	Rбенз, %
СН2СІ2	6	300	66,65	17,18
Етилацетат	6	300	54,27	1,94
СН2СІ2-ізопропанол-гексан	6	300	57,04	2,74
СН2СІ2-ізопропанол-етилацетат	8,4	300	57,84	5,00
СН2СІ2-ізопропанол-гексан	8,4	300	41,59	5,24
SPE-картридж	рН	С, нг/мл	Rкок, %	Rбенз, %
Chroma-bond C18 ec	6	300	56,03	80,38
SepPak C18	6	300	61,78	82,38
Izolute	6	300	60,38	84,68
Oasis MCX	6	300	60,08	91,66
Oasis HLB	6	300	68,65	91,85

Після осадження білків з метанолом, аналіти розділяли на колонці Zorbax SB-C18 в ізократичному режимі сумішшю метанолу і 0,1 % мурашиної кислоти (32:68, v/v) як елюенту при швидкості потоку 1 мл/хв. Для детектування бензоїлекгоніну проводили сканування в межах m/z 290 – 168, кокаїну – 304 – 182. Калібрувальні криві були лінійними в межах 20 – 2000 нг/мл для обох сполук (r > 0.992), межа кількісного визначення 20 нг/мл. Часи виходу кокаїну та бензоїлекгоніну становили відповідно 1,35 хв і 1,15 хв при загальному часі розгонки 1,7 хв.. Хроматограми із концентраціями на межі кількісного визначення даних речовин наведені на рис. 7.

Рис. 7. Хроматограма зразку плазми крові із вмістом кокаїну і бензоїлекгоніну по 20 нг/мл.

Розроблений метод може використовуватись в клінічній і судово-медичній експертизі для швидкого визначення кількості кокаїну і бензоїлекгоніну в плазмі крові людини.

Автори [5] розробили методику визначення кокаїну і бензоїлекгоніну в сечі людини із використанням 2-х колонок для ВЕРХ. Зроблена спеціально для даної методики передколонка (20 мм х 4,6 мм), набита сорбентом Alltech ODS-C18 (35 – 750 мкм), використовувалась для розділення і концентрування кокаїну і бензилекгоніну із сечі. Елюент із перед колонки безперервно подавався в аналітичну колонку (Spherisorb-C8, 250 мм х 4,6 мм х 5 мкм). Рухома фаза для екстрагування – 0,02 М фосфатний буфер (рН 6) зі швидкістю потоку 1 мл/хв.; в аналітичній колонці потік рухомої фази здійснювався в градієнтному режимі – розчин А містив 15 % ацетонітрилу, 15 % метанолу в фосфатному буфері 0,02 М (рН 3,0), розчин В містив 50 % ацетонітрилу, 45 % метанолу і 5 % фосфатного буферу 0,02 М (рН 3). Програма елюювання мала лінійну зміну градієнту потоку від 0 до 20 % розчину В протягом 9 хв і підтримувалась на такому рівні протягом 9 хв. Швидкість потоку 1,4 мл/хв.. Поверення до початкових умов відбувалось з 2-3 хв. Детектування проводили за допомогою УФ детектору із масивом діодів при 235 нм. Типова хроматограма нведена на рис. 8.

Рис. 8. Хроматограма суміші 1,0 мкг/мл кокаїну і 1,0 мкг/мл бензоїлекгоніну у воді (А) та сечі (В). Часи утримування становили 10,6 хв і 16,7 хв для кокаїну і безоїлекгоніну відповідно.

Ступінь вилучення кокаїну та бензоїлекгоніну становив щонайменше 96 % залежно від концентрації, це демонструє чудову ефективність екстракції за допомогою колонки. Межі виявлення при відношенні сигнал/шум 3/1 становили 0,08 і 0,15 мкг/мл при об’ємі, що інжектувався, 50 мкл. Пропускна здатність методики становить до 4-х зразків за годину. Запропонований метод застосували для дослідження 73 зразків сечі від потенційних наркоманів. Точність та відтворюваність запропонованого методу перевірили співставленням результатів із визначення кокаїну і бензоїлекгоніну за допомогою класичного для визначення наркотиків методу ГХ-МС в тих же умовах. Як видно із рис. 9, запропонований метод характеризується задовільною точністю.

Рис. 9. Порівняння ГХ-МС і ВЕРХ-УФ методів визначення бензоїлекгоніну у 58 зразках сечі від потенційних наркоманів.

У роботі [13] розглянуто чутливий, селективний та простий ВЕРХ з флюорометричним детектуванням для кількісного визначення кокаїну і трьох його метаболітів в сиворотці крові пацюків. Зразки крові центрифугували для відділення еритроцитів, лейкоцитів та тромбоцитів і заморожували до часу аналізу. Пробопідготовка полягала у рідин-рідинній екстракції сумішшю пропанолу і хлороформу із додаванням боратного буферу (рН 9,0) та наступного цетрифугування. Органічну фазу обережно зливали, випарювали досуха в потоці азоту і сухий залишок розчиняли в 50 мкл рухомої фази. Для інжектування використовували 20 мкл розчину. Хроматографічнене розділення проводили на колонці Hypersil BDS C18 (100 мм х 2,1 мм х 5 мкм) з ізократичним режимом потоку рухомої фази, що складалась із метанолу, ацетонітрилу і 25,8 мМ ацетатного буферу (рН 2,6), який містив 1,0·10^-4 М тетрабутиламонію фосфату (14:10:76, v/v/v). У роботі використовували флуоресцентний детектор, довжина хвилі збудження становила 230 нм, а емісії – 315 нм. Межа виявлення всіх сполук при цьому становила 0,5 нг/мл, RSD менше 7 %. Метод був апробований при вивченні фармакокінетики кокаїну; досліджували процес метаболізму кокаїну, введеного як перорально (р.о.), так і внутрішньовенно (і. v.), рис. 10.

Рис. 10. Концентраційно-часові профілі кокаїну та його основних метаболітів – бензоїлекгоніну і норкокаїну – після введення пероральної дози по 20 мг/кг і внутрішньовенної по 2 мг/кг.

У роботі [7] повідомлялось про розробку методу ВЕРХ у поєднання із тандемною мас-спектроскопією (електроспрей-іонізація та квадрупольний часопролітний аналізатор) для одночасного визначення амфетамінів (амфетаміну, метамфетаміну та «екстазі» MDA, MDMA and MDEA), опіатів (морфіну і кодеїну), кокаїну і бензоїлекгоніну в слині. Для дослідження потрібно лише 200 мкл вихідної проби, що є перевагою даної методики (пробо підготовка описана в розділі 3.1.3). Обернено-фазове хроматографування (Hypersil BDS phenyl column (2,1 мм діаметр, довжина 100 мм, розмір часточок 3 мкм) досліджуваної суміші проводять у умовах лінійного градієнту від 6 до 67,6 % метанолу у воді, при цьому і органічна, і водна фаза містить 10 мМ амоній форміату з рН 5, протягом 20 хв за швидкості потоку 0,2 мл/хв. Загальний час хроматографування становив 28 хв. Типова отримана хроматограма наведена на рис. 11.

За даним методом межа визначення кокаїну становила 0,22 нг/мл.

Рис. 11. Хроматограми екстракту морфіну, кодеїну, бензоїлекгоніну і кокаїну (С = 10 нг/мл) в слині, що попередньо не містила наркотиків.