Влияние тяжелых металлов на рост микроорганизмов (дрожжей Sactharomyces cerevisiae)

Цель работы ‑ определить влияние солей тяжелых металлов на параметры роста культуры микроорганизмов (урожай биомассы, экономический коэффициент), физиологическую активность (скорость потребления кислорода) и вычислить константу ингибирования.

Тяжелые металлы являются сильными антимикробными веществами. Проникая во внутрь клетки, они взаимодействуют с белками цитоплазмы, образуя с ними не растворимые в воде соединения и вызывают тем самым их коагуляцию. Тяжелые металлы инактивируют ферменты, связываясь в группами активного центра. Так, соли ртути, серебра, мышьяка реагируют с сульфгидрильными группами, изменяя их структуру и нарушая их активность. Эти ингибиторы не отличаются специфичностью, а действуют на все ферменты содержащие сульфгидрильные группы.

Установлено, что антимикробное действие тяжелых металлов зависит от концентрации ионов металлов и от времени воздействия их на микробы. Гибель микроорганизмов при действии тяжелых металлов наступает в результате адсорбции положительно заряженных катионов, отрицательно заряженными клетками бактерий. Кроме того, ионов металлов, в особенности серебра, адсорбированные на поверхности бактериальной клетки, являются энергичными катализаторами в процессе окисления протоплазмы кислорода.

В математических моделях природных биологических процессов, происходящих в условиях техногенной нагрузки, и в математических моделях природоохранных биотехнологий для количественного описания действия ингибиторов используют константу ингибирования Константа ингибирования – концентрация ингибитора (например, тяжелого металла), при которой наблюдается 50% снижение физиологической активности биоты.

Оборудование, реактивы, материалы:

3 конические колбы на 100 см³; стеклянные воронки, бумажные фильтры, оборудование и реактивы для определения ХПК, оборудование для определение концентрации биомассы – нефелометрическим методами или методами прямого счета в камере Горяева (лабораторная работа № 2), лабораторный шуттель-аппарат, питательная среда, кислородомер, микрокомпрессор, магнитная мешалка, стеклянный стаканчик на 100 см³, секундомер.

Порядок выполнения работы:

1. Готовят раствор CuSО₄. 100 мг CuSО₄∙5Н₂О растворяют в 100 см³ дистиллированной воды. Концентрация Cu²⁺ в этом растворе составляет 0,26 мг/ см³;

2. Готовят 200 см³ питательной среды: глюкоза ‑ 10, (NH₄)₂SO₄ – 0,5, KH₂PO₄ – 0,5 г/дм³. Отбирают 40 см³ для анализа ХПК;

3. В оставшуюся питательную среду вводят культуру дрожжей Sactharomyces cerevisiae. В 3 конические колбочки отливают по 50 см³ суспензии микроорганизмов в питательной среде. Колбочки помечают и в опытные варианты вводят раствор CuSО₄: № 1 – контрольная (без добавления раствора CuSО₄), в № 2 добавляют 0,2 см³ раствора CuSО₄ (который создает в микробной суспензию концентрацию Cu²⁺ 1 мг/дм³), в № 3 добавляют 1,0 см³ раствора CuSО₄ (который создает в микробной суспензию концентрацию Cu²⁺ 5 мг/дм³). Колбы с суспензией биомассы в питательной среде устанавливают в шуттель-аппарате и включают встряхивание на 1-2 ч.

4. В оставшейся суспензии микроорганизмов определяют концентрацию биомассы нефелометрически и методом прямого счета в камере Горяева (лабораторная работа № 2).

5. Определяют ХПК исходной питательной среды. 1 мг/дм³ глюкозы имеет ХПК =1 мг/дм³.

6. Останавливают встряхивание и проводят исследование характеристик микробных суспензии в контрольной и опытных колбах. В суспензиях определяют концентрацию биомассы (лабораторная работа № 2). При микроскопировании препаратов обращают внимание на размеры и состояние клеток дрожжей.

7. В контрольном и опытных вариантах микробных суспензий определяют скорость потребления кислорода (лабораторная работа № 6).

8. Суспензии фильтруют. Биомассу на фильтре отбрасывают, а в фильтрате определяют ХПК. 1 мг/дм³ глюкозы имеет ХПК =1 мг/дм³.

9. Рассчитывают параметры роста культуры микроорганизмов (урожай биомассы, экономический коэффициент), скорость потребления кислорода в опытном и контрольном вариантах

10. Строят зависимость эффекта ингибирования от концентрации тяжелого металла в и устанавливают константу ингибирования

Обработка данных

Эффект снижения физиологической активности биоты (урожая биомассы, экономического коэффициента, скорости потребления кислорода) при воздействии ингибитора по сравнению с развитием без ингибиторного воздействия рассчитывают по результатам экспериментальных исследований:

, (10)

где Э_и – эффект ингибирования, %;

А₀ ‑ физиологическая активность биоты без воздействия ингибитора;

А_и ‑ физиологическая активность биоты при воздействии ингибитора.

На основании определений эффектов снижения физиологической активности строят графическую зависимость эффекта ингибирования от концентрации ингибитора и устанавливают константу ингибирования (рис. 7).

Рисунок 7 ‑ Влияние концентрации ингибитора на эффект ингибирования

Константу ингибирования можно рассчитать и по формуле:

, (11)

где С_и – концентрация ингибитора, при которой установили эффект ингибирования.

Схема записи результатов

Концентрация Cu2+, мг/дм3	Влияние на потребление О2			Влияние на синтез биомассы			Влияние на стехиометрическую константу роста
	Скорость потребления О2, мг/г∙ч	эффект ингиби­рования ,%	Константа ингибирования	Урожай био­массы, г	эффект ингибирования,%	константа ингибирования	экономический коэффициент, г/кг	эффект ингибирования,%	константа ингибирования
0
1,0
5,0

Вопросы для самоподготовки:

1. Почему тяжелые металлы являются сильными антимикробными веществами?

2. Что такое константа ингибирования?

3. Какие параметры роста культуры микроорганизмов можно использовать для количественного определения константы ингибирования?

4. Какие показатели физиологической активности культуры микроорганизмов можно использовать для количественного определения константы ингибирования?

5. Являются ли тяжелые металлы специфическими ингибиторами?